s******a
发帖数: 472 | |
m******5
发帖数: 1383 | 2 是，楼主用了什么es line
【在 s******a 的大作中提到】
: 刚筛了第一窝老鼠，11个都是阴性。失望啊！！
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b********i
发帖数: 73 | 3 It will be much better if you use Albano C57BL/6 for breeding. Trash all
white mice. Half of black will have mutant allele, in theory. Save a lot
of genotyping work.
【在 s******a 的大作中提到】
: 刚筛了第一窝老鼠，11个都是阴性。失望啊！！
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s******a
发帖数: 472 | 4 JM8A3
【在 m******5 的大作中提到】
: 是，楼主用了什么es line
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s******a
发帖数: 472 | 5 Albino基因是显性的？我用AA基因型的老鼠breeding是吗？
想了一下确实是这个理
【在 b********i 的大作中提到】
: It will be much better if you use Albano C57BL/6 for breeding. Trash all
: white mice. Half of black will have mutant allele, in theory. Save a lot
: of genotyping work.
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H****N
发帖数: 997 | 6 Just don't give up yet. Try different chimeras. I had one line that I bred
for half a year with several chimeras. I only got one pup that carried the
mutant. That line has since been used by several labs and serveral papers,
including one Nature, and one Nature Medicine, have been published. One the
other hand, I had another line which I could never get germline transmission
. I had to retarget it. |
s******a
发帖数: 472 | 7 多谢！
继续筛。。。
the
transmission
【在 H****N 的大作中提到】
: Just don't give up yet. Try different chimeras. I had one line that I bred
: for half a year with several chimeras. I only got one pup that carried the
: mutant. That line has since been used by several labs and serveral papers,
: including one Nature, and one Nature Medicine, have been published. One the
: other hand, I had another line which I could never get germline transmission
: . I had to retarget it.
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s******a
发帖数: 472 | 8 多谢！
继续筛。。。
the
transmission
【在 H****N 的大作中提到】
: Just don't give up yet. Try different chimeras. I had one line that I bred
: for half a year with several chimeras. I only got one pup that carried the
: mutant. That line has since been used by several labs and serveral papers,
: including one Nature, and one Nature Medicine, have been published. One the
: other hand, I had another line which I could never get germline transmission
: . I had to retarget it.
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b**********s
发帖数: 435 | 9 我没用过JM8A3，LS讲的对，除外，LZ可以考虑下面几点， my 2 cents：
1. Chimera的百分比高吗？
2. germline transmission的几率跟ES细胞的状态有很大的关系。需要可以germline的
ES line，用Germline Transmission-tested的FBS，跟cell culture整个过程也有关系。
3. 既然有chimera了，这个问题比较次要了 -- ES的karyotyping结果怎样？
4. 要确保提取的DNA质量好，PCR不是假阴性。LZ扩的片段有多大呢？
5. 排除各种低级错误 -- 由于标记错误，用来做injection的ES不是targeted，而是
wild type。
我们用hybrid的ES细胞，筛选50-70只F1之后，没有阳性的，就重新做targeting。这种
情况比较少。
你筛选的数量不多，继续做breeding吧。 |
s****9
发帖数: 932 | 10 有时候就是ES cell的问题，我们曾经试过，7次都没有germline transmission。
Good luck
【在 s******a 的大作中提到】
: 多谢！
: 继续筛。。。
:
: the
: transmission
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s******a
发帖数: 472 | 11 多谢2cents :)
1. 8/14是chimera；
2. 文章里号称JM8A3应该是germline competent系。FBS等用的都是core facility的
SOP；
3. 没有做karyotyping；
4. 是说的筛ES克隆的PCR吗？BAC的阳性对照和阴性对照都很好，应该不会有问题。还
有southern。
5. 复苏之后都做二次validation，出错可能性应该不大。
现在又筛了一窝6个，另一只chimera的，也是都阴性。还有其他chimera，只能再
breeding再筛筛看。
系。
【在 b**********s 的大作中提到】
: 我没用过JM8A3，LS讲的对，除外，LZ可以考虑下面几点， my 2 cents：
: 1. Chimera的百分比高吗？
: 2. germline transmission的几率跟ES细胞的状态有很大的关系。需要可以germline的
: ES line，用Germline Transmission-tested的FBS，跟cell culture整个过程也有关系。
: 3. 既然有chimera了，这个问题比较次要了 -- ES的karyotyping结果怎样？
: 4. 要确保提取的DNA质量好，PCR不是假阴性。LZ扩的片段有多大呢？
: 5. 排除各种低级错误 -- 由于标记错误，用来做injection的ES不是targeted，而是
: wild type。
: 我们用hybrid的ES细胞，筛选50-70只F1之后，没有阳性的，就重新做targeting。这种
: 情况比较少。
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s******a
发帖数: 472 | 12 如果1个chimera繁殖1窝都阴性，还有必要用同一个chimera再试吗？
还是最好用其他的chimera？
【在 s****9 的大作中提到】
: 有时候就是ES cell的问题，我们曾经试过，7次都没有germline transmission。
: Good luck
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s******a
发帖数: 472 | |
m******5
发帖数: 1383 | 14 是，楼主用了什么es line
【在 s******a 的大作中提到】
: 刚筛了第一窝老鼠，11个都是阴性。失望啊！！
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b********i
发帖数: 73 | 15 It will be much better if you use Albano C57BL/6 for breeding. Trash all
white mice. Half of black will have mutant allele, in theory. Save a lot
of genotyping work.
【在 s******a 的大作中提到】
: 刚筛了第一窝老鼠，11个都是阴性。失望啊！！
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s******a
发帖数: 472 | 16 JM8A3
【在 m******5 的大作中提到】
: 是，楼主用了什么es line
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s******a
发帖数: 472 | 17 Albino基因是显性的？我用AA基因型的老鼠breeding是吗？
想了一下确实是这个理
【在 b********i 的大作中提到】
: It will be much better if you use Albano C57BL/6 for breeding. Trash all
: white mice. Half of black will have mutant allele, in theory. Save a lot
: of genotyping work.
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H****N
发帖数: 997 | 18 Just don't give up yet. Try different chimeras. I had one line that I bred
for half a year with several chimeras. I only got one pup that carried the
mutant. That line has since been used by several labs and serveral papers,
including one Nature, and one Nature Medicine, have been published. One the
other hand, I had another line which I could never get germline transmission
. I had to retarget it. |
s******a
发帖数: 472 | 19 多谢！
继续筛。。。
the
transmission
【在 H****N 的大作中提到】
: Just don't give up yet. Try different chimeras. I had one line that I bred
: for half a year with several chimeras. I only got one pup that carried the
: mutant. That line has since been used by several labs and serveral papers,
: including one Nature, and one Nature Medicine, have been published. One the
: other hand, I had another line which I could never get germline transmission
: . I had to retarget it.
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b**********s
发帖数: 435 | 20 我没用过JM8A3，LS讲的对，除外，LZ可以考虑下面几点， my 2 cents：
1. Chimera的百分比高吗？
2. germline transmission的几率跟ES细胞的状态有很大的关系。需要可以germline的
ES line，用Germline Transmission-tested的FBS，跟cell culture整个过程也有关系。
3. 既然有chimera了，这个问题比较次要了 -- ES的karyotyping结果怎样？
4. 要确保提取的DNA质量好，PCR不是假阴性。LZ扩的片段有多大呢？
5. 排除各种低级错误 -- 由于标记错误，用来做injection的ES不是targeted，而是
wild type。
我们用hybrid的ES细胞，筛选50-70只F1之后，没有阳性的，就重新做targeting。这种
情况比较少。
你筛选的数量不多，继续做breeding吧。 |
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s****9
发帖数: 932 | 21 有时候就是ES cell的问题，我们曾经试过，7次都没有germline transmission。
Good luck
【在 s******a 的大作中提到】
: 多谢！
: 继续筛。。。
:
: the
: transmission
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s******a
发帖数: 472 | 22 多谢2cents :)
1. 8/14是chimera；
2. 文章里号称JM8A3应该是germline competent系。FBS等用的都是core facility的
SOP；
3. 没有做karyotyping；
4. 是说的筛ES克隆的PCR吗？BAC的阳性对照和阴性对照都很好，应该不会有问题。还
有southern。
5. 复苏之后都做二次validation，出错可能性应该不大。
现在又筛了一窝6个，另一只chimera的，也是都阴性。还有其他chimera，只能再
breeding再筛筛看。
系。
【在 b**********s 的大作中提到】
: 我没用过JM8A3，LS讲的对，除外，LZ可以考虑下面几点， my 2 cents：
: 1. Chimera的百分比高吗？
: 2. germline transmission的几率跟ES细胞的状态有很大的关系。需要可以germline的
: ES line，用Germline Transmission-tested的FBS，跟cell culture整个过程也有关系。
: 3. 既然有chimera了，这个问题比较次要了 -- ES的karyotyping结果怎样？
: 4. 要确保提取的DNA质量好，PCR不是假阴性。LZ扩的片段有多大呢？
: 5. 排除各种低级错误 -- 由于标记错误，用来做injection的ES不是targeted，而是
: wild type。
: 我们用hybrid的ES细胞，筛选50-70只F1之后，没有阳性的，就重新做targeting。这种
: 情况比较少。
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s******a
发帖数: 472 | 23 如果1个chimera繁殖1窝都阴性，还有必要用同一个chimera再试吗？
还是最好用其他的chimera？
【在 s****9 的大作中提到】
: 有时候就是ES cell的问题，我们曾经试过，7次都没有germline transmission。
: Good luck
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s******a
发帖数: 472 | 24 我来汇报一下我的结果。我手上的chimera，除去一部分不育的，其他的：
要么第一次就成功，第一窝就有germline transmission；
要么4-5窝之后仍然没有germline transmission；
我用的ESC细胞是B6的，受体囊胚也是B6的，我现在的感觉是如果第一窝没有，以后的
希望很渺茫。
如果ESC是129，受体囊胚是B6，很可能129干细胞生精比B6干细胞晚，所以有可能你可
以在后面几窝得到germline。
【在 s******a 的大作中提到】
: 如果1个chimera繁殖1窝都阴性，还有必要用同一个chimera再试吗？
: 还是最好用其他的chimera？
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l********e
发帖数: 415 | 25 我也用这个ES细胞，5只chimera只有一只是公的。这只公的和wildtype生了大概200-
250只pup，只有一只germ line transmission ...
【在 s******a 的大作中提到】
: 如果1个chimera繁殖1窝都阴性，还有必要用同一个chimera再试吗？
: 还是最好用其他的chimera？
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l********e
发帖数: 415 | 26 JM8A3是杂合的，所以还会有agouti ...
【在 b********i 的大作中提到】
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s******a
发帖数: 472 | 27 好有毅力，200-250只得有多少窝啊。
理论上这些chimera应该bias公的
【在 l********e 的大作中提到】
: 我也用这个ES细胞，5只chimera只有一只是公的。这只公的和wildtype生了大概200-
: 250只pup，只有一只germ line transmission ...
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s******a
发帖数: 472 | 28 250只里有多少是agouti的？
我感觉一窝里只要有agouti pub，基本上就有戏
【在 l********e 的大作中提到】
: JM8A3是杂合的，所以还会有agouti ...
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D*a
发帖数: 6830 | 29 无所谓吧，多弄几窝同时breeding，一个公的俩母的，别一个一个来。
当然如果连着四五窝都是没有那估计就没有了。
你应该从毛色上分一下，大大省事。
【在 s******a 的大作中提到】
: 如果1个chimera繁殖1窝都阴性，还有必要用同一个chimera再试吗？
: 还是最好用其他的chimera？
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s******a
发帖数: 472 | 30 嗯，后来就有“明白”了
：）
【在 D*a 的大作中提到】
: 无所谓吧，多弄几窝同时breeding，一个公的俩母的，别一个一个来。
: 当然如果连着四五窝都是没有那估计就没有了。
: 你应该从毛色上分一下，大大省事。
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D*a
发帖数: 6830 | 31 原来是个老帖啊..
【在 s******a 的大作中提到】
: 嗯，后来就有“明白”了
: ：）
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a*******a
发帖数: 4233 | 32 进germline和es状态关系非常大，给你个极端的例子，我们有一阵子怎么都不进，过了
两年换了个养细胞的技术员就好了
【在 s******a 的大作中提到】
: 多谢2cents :)
: 1. 8/14是chimera；
: 2. 文章里号称JM8A3应该是germline competent系。FBS等用的都是core facility的
: SOP；
: 3. 没有做karyotyping；
: 4. 是说的筛ES克隆的PCR吗？BAC的阳性对照和阴性对照都很好，应该不会有问题。还
: 有southern。
: 5. 复苏之后都做二次validation，出错可能性应该不大。
: 现在又筛了一窝6个，另一只chimera的，也是都阴性。还有其他chimera，只能再
: breeding再筛筛看。
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l********e
发帖数: 415 | 33 从头到尾只有那一只 ... 一瞬间还以为眼花了
【在 s******a 的大作中提到】
: 250只里有多少是agouti的？
: 我感觉一窝里只要有agouti pub，基本上就有戏
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