v***a
发帖数: 1242 | 1 请见附图：
1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
重新设计了primer也仍旧如此。
请高手赐教。。。 |
y******s
发帖数: 92 | 2 PCR效率问题。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下，试不出来才怪。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图：
: 1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。
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v***a
发帖数: 1242 | 3 谢谢。1、5没试过。
问题是我的这些sample基本都是duplicate dish，细胞情况类似，为什么有的target
gene可以扩增到，而有的完全不可以呢？
包子已发。
【在 y******s 的大作中提到】
: PCR效率问题。
: 1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
: 2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
: cycle数。
: 3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
: 4. PCR样品在4度assembly。
: 5. 换个针对性的polymerase。
: 这5个都试一下，试不出来才怪。
:
: silencing.
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y******s
发帖数: 92 | 4 如果GC Rich （>60%）的话试1应该就可以了 （try gradient or 3% DMSO）。
样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢。1、5没试过。
: 问题是我的这些sample基本都是duplicate dish，细胞情况类似，为什么有的target
: gene可以扩增到，而有的完全不可以呢？
: 包子已发。
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v***a
发帖数: 1242 | 5 谢谢你，回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
【在 y******s 的大作中提到】
: 如果GC Rich （>60%）的话试1应该就可以了 （try gradient or 3% DMSO）。
: 样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
: 另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
: 是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。
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l***y
发帖数: 638 | 6 直接western吧，反正KD光测个RNA也没啥意义
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢你，回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
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C**S
发帖数: 522 | 7 "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。 |
v***a
发帖数: 1242 | 8 找不到好的特异性高的抗体，WB出来都没有变化。所以用RNA看。痛苦。
【在 l***y 的大作中提到】
: 直接western吧，反正KD光测个RNA也没啥意义
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v***a
发帖数: 1242 | 9 现在这个产物是300多bp的，应该还好？
【在 C**S 的大作中提到】
: "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
: －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
: 设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。
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b****r
发帖数: 17995 | 10 也许引物问题，根本不是扩的你想要的东西。测序证实一下先再往下做吧 |
d****i
发帖数: 2346 | 11
能不能再短点看看。300对我来说心里不塌实的。。
【在 v***a 的大作中提到】
: 现在这个产物是300多bp的，应该还好？
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m***o
发帖数: 272 | 12 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
,统统处理一下,没坏处. |
g*********9
发帖数: 3528 | 13 有些RNA的确copy很低的，虽然蛋白看着还成。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图：
: 1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。
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v***a
发帖数: 1242 | 14 多谢。打算以后都要用Dnase处理。
intron
【在 m***o 的大作中提到】
: 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
: ,统统处理一下,没坏处.
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