l**********t
发帖数: 138 | |
s****9
发帖数: 932 | 2 qPCR的Ct值怎么能够预测蛋白浓度，这个取决你放了多少的cDNA还有你的Prime设计
没有人会有经验回答这个问题。
【在 l**********t 的大作中提到】
: 有经验的请说说。
: 谢了！
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M*****n
发帖数: 16729 | 3 cDNA abundance和 protein abundance 没有直接correlation. |
l**********t
发帖数: 138 | 4 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右，18s在12左右，我觉得蛋白表达应该不会很强 |
z*******6
发帖数: 679 | 5 18s为啥这么高的Ct...
【在 l**********t 的大作中提到】
: 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右，18s在12左右，我觉得蛋白表达应该不会很强
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s******y
发帖数: 28562 | 6 不同的primer 之间不能直接比较的。
而且，RNA 的量和蛋白的量不是一回事。有些蛋白RNA虽然多，但是蛋白降解得快，正
常情况下含量也不高
【在 l**********t 的大作中提到】
: 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右，18s在12左右，我觉得蛋白表达应该不会很强
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y****i
发帖数: 2194 | 7 如果你gapdh在16左右，目标蛋白在32，95%以上的机会你直接做western是看不到蛋白的
这么说吧 ct值低 不代表你一定能检测到蛋白（由于其他人谈到的各种primer，蛋白降
解等等原因）
但是ct值高于30了，基本可以代表你用straight wetern检测不到蛋白
但如果你可以先IP，或者用其他的方法enrich你的蛋白 还是有可能的
【在 l**********t 的大作中提到】
: 同样的cDNA检测gapdh时Ct值在16左右，18s在12左右，我觉得蛋白表达应该不会很强
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a*******a
发帖数: 4233 | 8 完全可能检测到
蛋白降解速度不确定.
抗体效价不确定
这些都是影响wb的重要条件
我们有做gapdh ct15, candidate32-34的一个基因 |
D****g
发帖数: 275 | 9 总结一下，有80％的可能性检测不到，20％的可能性监测到。 |
m****M
发帖数: 360 | 10 CT值和蛋白表达量没有直接的关系。以上各位哥们都说了。
还有一点，CT值和PCR扩增效率的关系。同一个基因，用不同的引物扩增，都能差几个
CT。也就是说，引物设计的不好，扩增效率差，你CT值会很大。扩增效率好的引物，扩
增效率好，信号强，CT值就小。
另外，你如果用SYBGREEN的话，扩增片段的长短也会影响信号的强弱，从而影响CT值。
３００bp的和１５０bp的同样扩增效率的引物，CT值会差别很大。 |
l**********t
发帖数: 138 | 11 回复上面提到的
我用两对不同的primer检测，产物都在100bp左右，用的是SYBRGREEN，Ct值差不多都在
32左右 |
m****M
发帖数: 360 | 12 我断断续续做了将近１０年的qRT-PCR，尤其是后来在一个实验室几乎每天就做这个，
而且是大量筛选。从表达文库挑出基因，设计引物，专个用qRT-PCR进行再次对文库中
有差别的进行一个一个验证。主要检测小RNA和mRNA的表达分析。，做了将近３年，几
乎可以说什么样的情况都遇到过（有点自吹，请不要拍砖）。
有时对一个基因很感兴趣，出来qPCR结果和文库不一样，或一样但是表达量上有差异。
同一个基因，在不同位置设计引物和所扩增片段大小，对qRT-PCR CT value来说都都很
有讲究。有时一个基因有不同的isoform，如果没有注意到这些，就会失去很多的发现
，甚至几篇文章。有时间了我准备写个关于QRT-PCR的BLOG共大家分享。
【在 l**********t 的大作中提到】
: 回复上面提到的
: 我用两对不同的primer检测，产物都在100bp左右，用的是SYBRGREEN，Ct值差不多都在
: 32左右
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a*****n
发帖数: 2835 | 13 western blot depends too much on a good antibody.
【在 l**********t 的大作中提到】
: 回复上面提到的
: 我用两对不同的primer检测，产物都在100bp左右，用的是SYBRGREEN，Ct值差不多都在
: 32左右
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q***7
发帖数: 144 | 14 如果用SybrGreen，３０个cycle以后的我基本都不考虑，跑个胶看看你就知道，那基本
上是引物二聚体.
上面那个仁兄说的对，可以适当增加点PCR长度，我有时用４００bp左右，因为结合较
多的dye可以得到非常好的信号
【在 l**********t 的大作中提到】
: 回复上面提到的
: 我用两对不同的primer检测，产物都在100bp左右，用的是SYBRGREEN，Ct值差不多都在
: 32左右
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