b******s
发帖数: 5365 | 1 从来没有做过B cell,现在要在B cell line里看一个细胞内蛋白,用一样的抗体,flow
cytometry没问题但做cofocal isotype control 的背景很强.目前为止blocking 效果
最好的就是老鼠血清(用的抗体是monoclonal mouse antibody directly conjugated
with Alexa Fluor),但问题是背景没了,信号也弱了好多.这个实验组和isocontrol 比
起来亮不了多少.现在打算用1抗加2抗做,一般是用和二抗同种的血清来做blocking,但
听之前染过这个蛋白的人说,二抗血清对B cell Fc没什么作用.我的问题如下:
1. 不知道这种情况下能不能先做Fc blocking再用二抗血清block?
2.Caltac Laboratories (now belong to Invitrogen)原来有个抗CD32,但不连接荧光
素的已经不卖了,而且那个也是从老鼠养出来的.请问有什么非老鼠的抗体或血清适合做
human B cell FcR blocking?
3. 做co-staining 的时候,有两个不同的2抗,goat and donkey,能不能mix goat and
donkey serum for blocking? 还是一定要弄到同种的2抗?
多谢! | b******s
发帖数: 5365 | 2 唉,都被Nature的大水淹了.继续三伏天头顶三黄包跪求! | b******s
发帖数: 5365 | | b******s
发帖数: 5365 | | o**d
发帖数: 3080 | 5 你做confocal用的isotype control是和做flow用的一样吗？
一般做flow都是先block FcR加封闭（我一般是一起做），再染色，所以我想做cofocal
应该也一样。
你说你的目的蛋白是胞内的，那么做flow的时候一定做了破膜，我对cofocal不是很了
解，但是你是否也应该增加膜的通透性？因为也用可能是你的antibody没有进到细胞内。
希望对你有帮助。 | b******s
发帖数: 5365 | 6 用的抗体和isotype都是和flow一样的.做confocal 时先用4%PFA fix然后用0.1%
triton-X100 permeablize.应该不是通透性的问题,因为我同时染了另一个细胞内蛋白,
那个的染色信号就很好.
请问你用什么做block FcR?你说一起做,是不是指把block FcR的 reagent 和二抗血清
混合一起孵?谢谢!
cofocal
内。
【在 o**d 的大作中提到】
: 你做confocal用的isotype control是和做flow用的一样吗？
: 一般做flow都是先block FcR加封闭（我一般是一起做），再染色，所以我想做cofocal
: 应该也一样。
: 你说你的目的蛋白是胞内的，那么做flow的时候一定做了破膜，我对cofocal不是很了
: 解，但是你是否也应该增加膜的通透性？因为也用可能是你的antibody没有进到细胞内。
: 希望对你有帮助。
| b******s
发帖数: 5365 | | o**d
发帖数: 3080 | 8 我一直都是做鼠Bcell的flow，而且基本上直标的抗体。而且我们实验室用的FcRblock
是自己养的单抗上清。
看了你的描述，是不是可能用4％PFA固定的时候把抗原给破坏了？如果可能的话，试一
下你做flow用的fix－permeblize buffer和条件来做cofocal。
祝好运。
白,
【在 b******s 的大作中提到】
: 用的抗体和isotype都是和flow一样的.做confocal 时先用4%PFA fix然后用0.1%
: triton-X100 permeablize.应该不是通透性的问题,因为我同时染了另一个细胞内蛋白,
: 那个的染色信号就很好.
: 请问你用什么做block FcR?你说一起做,是不是指把block FcR的 reagent 和二抗血清
: 混合一起孵?谢谢!
:
: cofocal
: 内。
| b******s
发帖数: 5365 | 9 恩,我忘记了flow和confocal的差别----flow做的是表面染色(这个蛋白在细胞表面也表
达),当时染色做的是活细胞;而confocal看的是细胞内的蛋白,确实不一样.
谢谢提醒,虽然一时还没想到很好的对策,不过还是很感谢.请接包子!
也欢迎其他免疫牛人指点,我还有一些库存包子.
FcRblock
【在 o**d 的大作中提到】
: 我一直都是做鼠Bcell的flow，而且基本上直标的抗体。而且我们实验室用的FcRblock
: 是自己养的单抗上清。
: 看了你的描述，是不是可能用4％PFA固定的时候把抗原给破坏了？如果可能的话，试一
: 下你做flow用的fix－permeblize buffer和条件来做cofocal。
: 祝好运。
:
: 白,
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