w********w
发帖数: 469 | 1 能同时表达3个或以上的基因的mammalian expression vector,谁能推荐一个啊？谢谢 |
w********w
发帖数: 469 | |
s******s
发帖数: 13035 | 3 教你一招，这个不需要啥特殊载体，直接加2A就可以了
2A包括T2A，P2A等等，大多数是十几二十个aa的sequence, 能够
mediate co-translational cleavage，翻成白话就是一个蛋白里面
有这个sequence, 一边翻译一边就被切两半了。你要做的就是表达一
个大蛋白，中间插上2A，表达出来自己就变成四五个小蛋白了，好处
是表达量相同；类似的可以加ires，不过后面蛋白表达量小。
这么多基因怎么clone成一个大蛋白呢并且加2A呢？很简单，google
neb gibson assembly mix就知道了。PCR的时候头上加部分2A sequence，
四五个片段放在一起，加mix "biu。。。"的一声就变成一个片段了，呵呵
【在 w********w 的大作中提到】
: 能同时表达3个或以上的基因的mammalian expression vector,谁能推荐一个啊？谢谢
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w********w
发帖数: 469 | 4 谢谢。好主意。类似的方法想过了， 就是不想太多的cloning, 最好有卖的现成的
vector， 知道有同时表达2个的，不知道3个或以上的。
【在 s******s 的大作中提到】
: 教你一招，这个不需要啥特殊载体，直接加2A就可以了
: 2A包括T2A，P2A等等，大多数是十几二十个aa的sequence, 能够
: mediate co-translational cleavage，翻成白话就是一个蛋白里面
: 有这个sequence, 一边翻译一边就被切两半了。你要做的就是表达一
: 个大蛋白，中间插上2A，表达出来自己就变成四五个小蛋白了，好处
: 是表达量相同；类似的可以加ires，不过后面蛋白表达量小。
: 这么多基因怎么clone成一个大蛋白呢并且加2A呢？很简单，google
: neb gibson assembly mix就知道了。PCR的时候头上加部分2A sequence，
: 四五个片段放在一起，加mix "biu。。。"的一声就变成一个片段了，呵呵
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l******g
发帖数: 1623 | 5 表达几个受制于plasmid的大小. 一个vector, 你可以随便装几个expression
cassettes. 工业界用这种方法生产蛋白, 都是每升以克计
【在 w********w 的大作中提到】
: 谢谢。好主意。类似的方法想过了， 就是不想太多的cloning, 最好有卖的现成的
: vector， 知道有同时表达2个的，不知道3个或以上的。
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M**a
发帖数: 4816 | 6 nice.
【在 s******s 的大作中提到】
: 教你一招，这个不需要啥特殊载体，直接加2A就可以了
: 2A包括T2A，P2A等等，大多数是十几二十个aa的sequence, 能够
: mediate co-translational cleavage，翻成白话就是一个蛋白里面
: 有这个sequence, 一边翻译一边就被切两半了。你要做的就是表达一
: 个大蛋白，中间插上2A，表达出来自己就变成四五个小蛋白了，好处
: 是表达量相同；类似的可以加ires，不过后面蛋白表达量小。
: 这么多基因怎么clone成一个大蛋白呢并且加2A呢？很简单，google
: neb gibson assembly mix就知道了。PCR的时候头上加部分2A sequence，
: 四五个片段放在一起，加mix "biu。。。"的一声就变成一个片段了，呵呵
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s******s
发帖数: 13035 | 7 现成卖的不知道，不过表达四个以上的很正常，比如ips的vector. 问题是
每一个都装上下游序列实在太大了，而且克隆起来很不方遍。所以我建议你
用2A配合gibson，克隆方便，体积小
【在 w********w 的大作中提到】
: 谢谢。好主意。类似的方法想过了， 就是不想太多的cloning, 最好有卖的现成的
: vector， 知道有同时表达2个的，不知道3个或以上的。
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w********w
发帖数: 469 | 8 谢谢。可以考虑2A的方法。 不过ips vector你有名字 和相关信息吗？
【在 s******s 的大作中提到】
: 现成卖的不知道，不过表达四个以上的很正常，比如ips的vector. 问题是
: 每一个都装上下游序列实在太大了，而且克隆起来很不方遍。所以我建议你
: 用2A配合gibson，克隆方便，体积小
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c**a
发帖数: 67 | 9 好主意！
F2A,E2A,P2A,T2A 的序列由长到短，哪个切割效率比较高？如果效率相当，我倾向于用
T2A,毕竟短一些。
【在 s******s 的大作中提到】
: 现成卖的不知道，不过表达四个以上的很正常，比如ips的vector. 问题是
: 每一个都装上下游序列实在太大了，而且克隆起来很不方遍。所以我建议你
: 用2A配合gibson，克隆方便，体积小
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y****m
发帖数: 37 | 10 heard of PCR cloning, clontech
【在 w********w 的大作中提到】
: 谢谢。好主意。类似的方法想过了， 就是不想太多的cloning, 最好有卖的现成的
: vector， 知道有同时表达2个的，不知道3个或以上的。
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x**e
发帖数: 163 | |
s******s
发帖数: 13035 | 12 不记得了，就是四factor那种
【在 w********w 的大作中提到】
: 谢谢。可以考虑2A的方法。 不过ips vector你有名字 和相关信息吗？
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s******s
发帖数: 13035 | 13 P2A，T2A都不错啊
【在 c**a 的大作中提到】
: 好主意！
: F2A,E2A,P2A,T2A 的序列由长到短，哪个切割效率比较高？如果效率相当，我倾向于用
: T2A,毕竟短一些。
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w********w
发帖数: 469 | 14 就是有个问题这些放在任一express vector都行吧， 还有就是cleave后会留17-20aa
【在 s******s 的大作中提到】
: P2A，T2A都不错啊
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w********w
发帖数: 469 | 15 有vector的信息吗？谢谢
【在 y****m 的大作中提到】
: heard of PCR cloning, clontech
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