f********s
发帖数: 115 | 1 想请教一个实验问题：有没有人尝试过用液体培养基加细胞因子来分化过细胞？
我想做这样一个实验，把MEP用FACS分选出来，然后在每一个96孔板的孔里面放一个细
胞。分化7天以后把这个孔里的细胞cytospin + staining， 然后看每个MEP都能分化成
什么种类的子细胞。用这个实验来比较wt 和mut 的区别。我看到一个protocol， 用
IMDM+ SCF，IL3, IL11, GM-SCF, FLT3-Ligand, TPＯ和EPO 来养细胞。我没有做过液
体培养基，一般用的都是methylcult medium,所以不知道液体培养基的效果好不好。有
没有有经验的人来说一说呢？
不知道在哪里看到说semi-solid的培养基比纯液体好，但是考虑到最后要cytospin,
semi-solid的培养基太粘了，洗一下的话又怕细胞丢失太多，因为本来一个细胞就分化
不出太多细胞。
多谢多谢！！ |
m*****u
发帖数: 15526 | 2 血液细胞很多都有游走，贴壁的特性。用96孔板，液体培养基最后怎么收集分析？用半
固体培养基的重要作用是可以观察血细胞集落，有经验的根据集落形态，颜色，大小就
可以判断progenitor的分化情况。细胞集落也容易收集分析，验证
【在 f********s 的大作中提到】
: 想请教一个实验问题：有没有人尝试过用液体培养基加细胞因子来分化过细胞？
: 我想做这样一个实验，把MEP用FACS分选出来，然后在每一个96孔板的孔里面放一个细
: 胞。分化7天以后把这个孔里的细胞cytospin + staining， 然后看每个MEP都能分化成
: 什么种类的子细胞。用这个实验来比较wt 和mut 的区别。我看到一个protocol， 用
: IMDM+ SCF，IL3, IL11, GM-SCF, FLT3-Ligand, TPＯ和EPO 来养细胞。我没有做过液
: 体培养基，一般用的都是methylcult medium,所以不知道液体培养基的效果好不好。有
: 没有有经验的人来说一说呢？
: 不知道在哪里看到说semi-solid的培养基比纯液体好，但是考虑到最后要cytospin,
: semi-solid的培养基太粘了，洗一下的话又怕细胞丢失太多，因为本来一个细胞就分化
: 不出太多细胞。
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f********s
发帖数: 115 | 3 96孔板每一个孔就是200ul 培养基，最后把这200ul全部吸出来，细胞全部离心到slide
上面，然后染色就可以看到子细胞的形态。在这种情况下，不靠细胞集落的形态分析，
直接看每一个细胞的形态，根据形态可以判断子细胞的类型。
根据细胞集落的形态，颜色，大小来判断progenitor的分化对于wildtype还比较可靠，
对于mutant来说不可靠，各种不正常都可能发生。最后还是需要挑单克隆，看细胞来进
一步验证。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 血液细胞很多都有游走，贴壁的特性。用96孔板，液体培养基最后怎么收集分析？用半
: 固体培养基的重要作用是可以观察血细胞集落，有经验的根据集落形态，颜色，大小就
: 可以判断progenitor的分化情况。细胞集落也容易收集分析，验证
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m*****u
发帖数: 15526 | 4 分化的单核巨噬细胞，粒细胞很多是贴壁的。光吸出培养液根本收集不到这些细胞。96孔一个孔一个孔的彻底清洗，要累死。何况这样所有分化cell都mix在一起，镜子底下一个一个细胞形态辨别，计数。还得count 96孔的细胞，你自己想想有多少工作量。大的colony有几万个细胞也不稀奇.你说mutant集落形态会有变化不好认，不错，可是分散的单个细胞不是更难认？集落不好认，你可以挑出来做免疫染色或flowcytometry分析phenotype。一个一个分散的单个细胞你怎么分析phenotype？再怎么综合数据？
slide
【在 f********s 的大作中提到】
: 96孔板每一个孔就是200ul 培养基，最后把这200ul全部吸出来，细胞全部离心到slide
: 上面，然后染色就可以看到子细胞的形态。在这种情况下，不靠细胞集落的形态分析，
: 直接看每一个细胞的形态，根据形态可以判断子细胞的类型。
: 根据细胞集落的形态，颜色，大小来判断progenitor的分化对于wildtype还比较可靠，
: 对于mutant来说不可靠，各种不正常都可能发生。最后还是需要挑单克隆，看细胞来进
: 一步验证。
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m*****u
发帖数: 15526 | 5 另外，7天分化时间是不够的。7天只能看precursor的分化情况。更接近干细胞的细胞
需要更长的时间。一般半固体培养基也是14-21天观察。
【在 f********s 的大作中提到】
: 想请教一个实验问题：有没有人尝试过用液体培养基加细胞因子来分化过细胞？
: 我想做这样一个实验，把MEP用FACS分选出来，然后在每一个96孔板的孔里面放一个细
: 胞。分化7天以后把这个孔里的细胞cytospin + staining， 然后看每个MEP都能分化成
: 什么种类的子细胞。用这个实验来比较wt 和mut 的区别。我看到一个protocol， 用
: IMDM+ SCF，IL3, IL11, GM-SCF, FLT3-Ligand, TPＯ和EPO 来养细胞。我没有做过液
: 体培养基，一般用的都是methylcult medium,所以不知道液体培养基的效果好不好。有
: 没有有经验的人来说一说呢？
: 不知道在哪里看到说semi-solid的培养基比纯液体好，但是考虑到最后要cytospin,
: semi-solid的培养基太粘了，洗一下的话又怕细胞丢失太多，因为本来一个细胞就分化
: 不出太多细胞。
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f********s
发帖数: 115 | 6 en, 工作量的问题暂不考虑，因为挑单个集落来做免疫染色和flow的工作量跟我将一个
孔的细胞吸出来做染色和flow的工作量是一样的。我也不打算将所有的96个孔都吸出来
一个一个看。这不是重点。
我问这个问题的关键在于我不知道细胞分化本身在液体培养基和methylcult 培养基中
有没有差异，在所给的细胞因子都一样的情况下。也就是说全液体（细胞可以到处飘来
飘去）和半固体（对细胞有所支持，细胞不能飘来飘去）会导致细胞分化的程度不一样
吗？
你提到Mk和粒细胞会贴壁，是因为你做过液体培养而且看到过他们贴壁了是吗？谢谢你
提供这个信息，我会留心的。不知道你对于我上面提到的问题有没有更多的了解。谢谢！
96孔一个孔一个孔的彻底清洗，要累死。何况这样所有分化cell都mix在一起，镜子底
下一个一个细胞形态辨别，计数。还得count 96孔的细胞，你自己想想有多少工作量。
大的colony有几万个细胞也不稀奇.你说mutant集落形态会有变化不好认，不错，可是
分散的单个细胞不是更难认？集落不好认，你可以挑出来做免疫染色或flowcytometry
分析phenotype。一个一个分散的单个细胞你怎么分析phenotype？再怎么综合数据？
【在 m*****u 的大作中提到】
: 分化的单核巨噬细胞，粒细胞很多是贴壁的。光吸出培养液根本收集不到这些细胞。96孔一个孔一个孔的彻底清洗，要累死。何况这样所有分化cell都mix在一起，镜子底下一个一个细胞形态辨别，计数。还得count 96孔的细胞，你自己想想有多少工作量。大的colony有几万个细胞也不稀奇.你说mutant集落形态会有变化不好认，不错，可是分散的单个细胞不是更难认？集落不好认，你可以挑出来做免疫染色或flowcytometry分析phenotype。一个一个分散的单个细胞你怎么分析phenotype？再怎么综合数据？
:
: slide
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f********s
发帖数: 115 | 7 谢谢你提到这个问题，我其实是打算做几个时间点的，只不过为了发帖简单一点就没写
那么多细节。
【在 m*****u 的大作中提到】
: 另外，7天分化时间是不够的。7天只能看precursor的分化情况。更接近干细胞的细胞
: 需要更长的时间。一般半固体培养基也是14-21天观察。
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m*****u
发帖数: 15526 | 8 工作量肯定是不一样的。对于典型的集落，用不着做免疫染色和flow。或者挑几个做就
可以了。而且集落细胞数有多少，有多少集落完全可以估计。对于mix在一起的，只能
所有都做，每个集落细胞数量类型无从估计和比较。
至于在液体还是半固体中分化是否会不同，我没比较过。记得看过报道是跟液体培养有差异。差异多少不好说。即使都是半固体，methylcelluose 和软琼脂性质也不同。液体培养要换液，加fresh的细胞因子。换液可能导致细胞丢失，麻烦而且不太容易控制条件consistent。无论你用什么纯化方法，能形成集落的细胞只是其中一部分。用半固体培养基可以很方便的估计其中集落形成细胞的数量比例。不管是PBMC还是CD34。用单克隆接种要看的累死也未必能找到几个CFC。另外，单克隆细胞生长一般都会比细胞群体要差
谢！
【在 f********s 的大作中提到】
: en, 工作量的问题暂不考虑，因为挑单个集落来做免疫染色和flow的工作量跟我将一个
: 孔的细胞吸出来做染色和flow的工作量是一样的。我也不打算将所有的96个孔都吸出来
: 一个一个看。这不是重点。
: 我问这个问题的关键在于我不知道细胞分化本身在液体培养基和methylcult 培养基中
: 有没有差异，在所给的细胞因子都一样的情况下。也就是说全液体（细胞可以到处飘来
: 飘去）和半固体（对细胞有所支持，细胞不能飘来飘去）会导致细胞分化的程度不一样
: 吗？
: 你提到Mk和粒细胞会贴壁，是因为你做过液体培养而且看到过他们贴壁了是吗？谢谢你
: 提供这个信息，我会留心的。不知道你对于我上面提到的问题有没有更多的了解。谢谢！
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m*p
发帖数: 226 | 9 很多drug screening 和 in vitro stem cell proliferation 就是这样作的。没有什
么新意。 |
s******y
发帖数: 28562 | 10 我没有做过血细胞分化啊，所以困惑的来问一下啊，
如果不加半固体培养基的话，乐意贴壁的细胞贴到培养板的底部不就完了么？
然后收集的时候先吸走液体，就把那种不贴壁的细胞移走了，然后再用trypsin
处理，不就把贴壁的细胞收集下来了么？
而且如果要直接在板上观测的话，多了那个半固体培养基反而麻烦，因为对焦
很麻烦的。
当然用半固体培养基的一个好处就是所有的细胞都不贴壁，可能在收集的时候比较
好办吧？但是如果不小心的话会把培养基什么的也收集下来，会很讨厌吧？
所以我奇怪的问一下，为什么一定要用这个半固体培养基啊？
【在 m*****u 的大作中提到】
: 血液细胞很多都有游走，贴壁的特性。用96孔板，液体培养基最后怎么收集分析？用半
: 固体培养基的重要作用是可以观察血细胞集落，有经验的根据集落形态，颜色，大小就
: 可以判断progenitor的分化情况。细胞集落也容易收集分析，验证
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m*****u
发帖数: 15526 | 11 半固体培基主要目的是估计你的细胞样本中colony forming cells 的数量，功能和类
型。无论你用PBMC还是CD34,能形成colony的细胞只是其中一部分。根据colony的数量
，形态，大小，颜色可以知道血细胞红系，粒系，单核巨噬各系progenitor的分布和
colony形成能力。在液体培养中，所有分化的lineage都mix一起，和不能形成colony的细
胞也混在一起，这样这些就都无法判断。
【在 s******y 的大作中提到】
: 我没有做过血细胞分化啊，所以困惑的来问一下啊，
: 如果不加半固体培养基的话，乐意贴壁的细胞贴到培养板的底部不就完了么？
: 然后收集的时候先吸走液体，就把那种不贴壁的细胞移走了，然后再用trypsin
: 处理，不就把贴壁的细胞收集下来了么？
: 而且如果要直接在板上观测的话，多了那个半固体培养基反而麻烦，因为对焦
: 很麻烦的。
: 当然用半固体培养基的一个好处就是所有的细胞都不贴壁，可能在收集的时候比较
: 好办吧？但是如果不小心的话会把培养基什么的也收集下来，会很讨厌吧？
: 所以我奇怪的问一下，为什么一定要用这个半固体培养基啊？
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s******y
发帖数: 28562 | 12 嗯，有道理。那种即使是不喜欢贴壁的细胞，在半固体培养基上也可以固定在
一个具体位置上吧？
我还有一个好奇的问题是，你们做血液培养的人，万一需要换培养液的时候怎么避免把
细胞吸走？
我能不能再问问你们在那个半固体培养基上收集细胞的时候，需要加trypsin 么？
的细
【在 m*****u 的大作中提到】
: 半固体培基主要目的是估计你的细胞样本中colony forming cells 的数量，功能和类
: 型。无论你用PBMC还是CD34,能形成colony的细胞只是其中一部分。根据colony的数量
: ，形态，大小，颜色可以知道血细胞红系，粒系，单核巨噬各系progenitor的分布和
: colony形成能力。在液体培养中，所有分化的lineage都mix一起，和不能形成colony的细
: 胞也混在一起，这样这些就都无法判断。
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m*****u
发帖数: 15526 | 13 半固体上是不换培养液的。细胞colony在半固体上固定在一个位置上。大的colony肉眼
可见，拿tip吸出来没什么问题
【在 s******y 的大作中提到】
: 嗯，有道理。那种即使是不喜欢贴壁的细胞，在半固体培养基上也可以固定在
: 一个具体位置上吧？
: 我还有一个好奇的问题是，你们做血液培养的人，万一需要换培养液的时候怎么避免把
: 细胞吸走？
: 我能不能再问问你们在那个半固体培养基上收集细胞的时候，需要加trypsin 么？
:
: 的细
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s******y
发帖数: 28562 | 14 谢谢。再问一个白痴问题啊，你们在96孔板上铺半固体培养基的时候，如何避免
形成弯曲的表面？还是无所谓？还有里面的胶质，是regular agarose, low-melting
point agarose,还是 methyl-cellulose？
【在 m*****u 的大作中提到】
: 半固体上是不换培养液的。细胞colony在半固体上固定在一个位置上。大的colony肉眼
: 可见，拿tip吸出来没什么问题
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f********s
发帖数: 115 | 15 你说的很多我都同意。只不过现在我想定量的的来分析一种特定的 progenitor （ex.
CMP） 分化到各个lineage 的能力。我觉得在把多个progenitor 接种到同一个盘子上
有几点非常影响我做定量分析：
1.你在挑集落的时候是可以看到集落的样子的，所以也许你会不自觉的多挑或者少挑某
些集落，引入bias;
2.在挑集落的时候，大的集落容易挑出来，小的集落不容易挑，即使挑了小集落在后续
实验过程中不知道怎么就不见了 (而且大小通常意味着不同的lineage)，也会严重影响
实验者的判断。
因此，我觉得一定要接种单细胞到96孔板里，在不看孔的情况下, 随机挑选比如说20个
孔来观察，这样可以得到各种百分比，比如说百分之多少的单细胞能形成集落，百分之
多少的细胞能形成红细胞集落，多少能形成粒细胞集落……不知道关于这一点你是否同
意？
在这个基础上，我想知道半固体和全液体培养基在这个实验里的优劣。我能想到的半固
体的坏处在于，1.如果你不看孔，不知道这个克隆在哪里，你就要把全部的200ul半固
体培养基吸出来，非常不利于cytospin. 2.而且半固体培养基会有一部分粘在tip上，
可能因此丢失大量细胞。
液体培养基没有我上述的问题，不过你提到的换液的问题我也要考虑一下。有没有可能
不换液？因为半固体培养就不换液，好像那些营养也能支持细胞生长2周。如果我只有
一个细胞在200ul里的话，只要培养基不变黄就说明培养基还好吧。如果万一要换液，
我可以随机选20个孔转移到24孔板，加入新的培养基就好了。
我最担心的就是液体培养基分化的结果和半固体不一样，这样我这次的实验跟之前的实
验结果就不衔接了。
不过真的很感谢你的热心回答！
有差异。差异多少不好说。即使都是半固体，methylcelluose 和软琼脂性质也不同。
液体培养要换液，加fresh的细胞因子。换液可能导致细胞丢失，麻烦而且不太容易控
制条件consistent。无论你用什么纯化方法，能形成集落的细胞只是其中一部分。用半
固体培养基可以很方便的估计其中集落形成细胞的数量比例。不管是PBMC还是CD34。用
单克隆接种要看的累死也未必能找到几个CFC。另外，单克隆细胞生长一般都会比细胞
群体要差
【在 m*****u 的大作中提到】
: 工作量肯定是不一样的。对于典型的集落，用不着做免疫染色和flow。或者挑几个做就
: 可以了。而且集落细胞数有多少，有多少集落完全可以估计。对于mix在一起的，只能
: 所有都做，每个集落细胞数量类型无从估计和比较。
: 至于在液体还是半固体中分化是否会不同，我没比较过。记得看过报道是跟液体培养有差异。差异多少不好说。即使都是半固体，methylcelluose 和软琼脂性质也不同。液体培养要换液，加fresh的细胞因子。换液可能导致细胞丢失，麻烦而且不太容易控制条件consistent。无论你用什么纯化方法，能形成集落的细胞只是其中一部分。用半固体培养基可以很方便的估计其中集落形成细胞的数量比例。不管是PBMC还是CD34。用单克隆接种要看的累死也未必能找到几个CFC。另外，单克隆细胞生长一般都会比细胞群体要差
:
: 谢！
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f********s
发帖数: 115 | 16 谢谢你的评论，不过我做这个实验不在于创新实验方法，只是为了比较WT和MUT的异同。
【在 m*p 的大作中提到】
: 很多drug screening 和 in vitro stem cell proliferation 就是这样作的。没有什
: 么新意。
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f********s
发帖数: 115 | 17 多谢sunnyday来捧场！
前面的问题microyu说得都很对。
我觉得弯曲的表面无所谓。里面的胶质用得比较多的是metylcullulose.
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢。再问一个白痴问题啊，你们在96孔板上铺半固体培养基的时候，如何避免
: 形成弯曲的表面？还是无所谓？还有里面的胶质，是regular agarose, low-melting
: point agarose,还是 methyl-cellulose？
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m*****u
发帖数: 15526 | 18 我们似乎注重的方面不一样。半固体培养更着重看群体情况而不是单一细胞集落。比较
wt和mu各lineage分化情况，如果是我的话会把相同浓度的wt和mu cell做倍比稀释，每
个浓度都接种到methylcellulose,观察计数集落数量，大小，种类。然后按这些指标分
别统计比较，观察有否差异。如果集落本身就有重大区别，再看集落本身的情况。如果
你能得到一个高纯的细胞群体，colony forming cell的比例很高，随机看孔也不是不
可以。不过这种纯化富集本身就可能导致bias。
【在 f********s 的大作中提到】
: 你说的很多我都同意。只不过现在我想定量的的来分析一种特定的 progenitor （ex.
: CMP） 分化到各个lineage 的能力。我觉得在把多个progenitor 接种到同一个盘子上
: 有几点非常影响我做定量分析：
: 1.你在挑集落的时候是可以看到集落的样子的，所以也许你会不自觉的多挑或者少挑某
: 些集落，引入bias;
: 2.在挑集落的时候，大的集落容易挑出来，小的集落不容易挑，即使挑了小集落在后续
: 实验过程中不知道怎么就不见了 (而且大小通常意味着不同的lineage)，也会严重影响
: 实验者的判断。
: 因此，我觉得一定要接种单细胞到96孔板里，在不看孔的情况下, 随机挑选比如说20个
: 孔来观察，这样可以得到各种百分比，比如说百分之多少的单细胞能形成集落，百分之
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m*****u
发帖数: 15526 | 19 我没在96孔板铺过。因为体积小，methylcellulose又很粘，很难控制体积精确。我只
用6孔板或35mm培养皿做这个。可以用agar也可以用methylcellulose。
methylcellulose stemcell有专门产品，所以很方便。用agar要自己配，热的时候混合
细胞和多种细胞因子，高温时又得保证不杀死细胞和不使细胞因子失活。并不好操作。
【在 s******y 的大作中提到】
: 谢谢。再问一个白痴问题啊，你们在96孔板上铺半固体培养基的时候，如何避免
: 形成弯曲的表面？还是无所谓？还有里面的胶质，是regular agarose, low-melting
: point agarose,还是 methyl-cellulose？
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