T*********y
发帖数: 643 | 1 正研究的一个蛋白有1500多个氨基酸，实验室一个博后原来合成10几个氨基酸的多肽打
兔子，没有得到好的抗体。因为我们希望得到很好的抗体做immunostaining,所以对抗
体的要求比较高。我现在打算从中选取个200-300aa长的两个片段，分别克隆到表达载
体中，然后细菌中表达纯化蛋白，然后送给公司制备两个多抗。我现在的问题是，如何
选取适合的蛋白片段？我所知道的是：1）选取的片段尽量不要含有非常保守的结构域
；2）选取的片段亲水性高，暴露在蛋白的表面。请问还有哪些其它因素需要考虑的？
另外有没有免费好用的软件可以预测抗原决定簇（epitope）？有这方面经验的朋友出
来指导一下，谢谢。 |
f**6
发帖数: 16 | 2 多抗？ 还是单抗？ 多抗，跑SDS-PAGE，将要的蛋白条带切下，直接免疫兔子，就可得
到多抗血清。单抗，另当别论。别太迷信软件，那是别人用来捣江湖的。如果做单抗的
话，可站内联系。 |
s******s
发帖数: 13035 | 3 都是这么说，不过我做过一些抗体的经验是，割胶出来免疫的抗体一般很脏，
最好的还是溶解在buffer里面的抗原。加tag的经验是gst虽然比较大，但是
效果最好。片段设计直接去问打兔子的公司，他们比较有经验
【在 f**6 的大作中提到】
: 多抗？ 还是单抗？ 多抗，跑SDS-PAGE，将要的蛋白条带切下，直接免疫兔子，就可得
: 到多抗血清。单抗，另当别论。别太迷信软件，那是别人用来捣江湖的。如果做单抗的
: 话，可站内联系。
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F**********6
发帖数: 90 | 4 I usually use 6XHIS tagged fusion protein (200-300aa) as an antigen to
immunize rabbit and at least 2 fragments are used for each gene.
So far I've got immunostaining-grade antiserum for several genes. |
v***a
发帖数: 1242 | 5 我做过一次，是选取了功能结构域，比如我已知此蛋白会bind到另一个蛋白，而且这是
它的主要功能之一，我就选取了这个binding domain。
仅供参考。
【在 T*********y 的大作中提到】
: 正研究的一个蛋白有1500多个氨基酸，实验室一个博后原来合成10几个氨基酸的多肽打
: 兔子，没有得到好的抗体。因为我们希望得到很好的抗体做immunostaining,所以对抗
: 体的要求比较高。我现在打算从中选取个200-300aa长的两个片段，分别克隆到表达载
: 体中，然后细菌中表达纯化蛋白，然后送给公司制备两个多抗。我现在的问题是，如何
: 选取适合的蛋白片段？我所知道的是：1）选取的片段尽量不要含有非常保守的结构域
: ；2）选取的片段亲水性高，暴露在蛋白的表面。请问还有哪些其它因素需要考虑的？
: 另外有没有免费好用的软件可以预测抗原决定簇（epitope）？有这方面经验的朋友出
: 来指导一下，谢谢。
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j****x
发帖数: 1704 | 6 一般公司都可以提供rational antigen design的服务，从序列中特征性选取多肽片段
然后交联到BSA等载体蛋白上再制备单抗或多抗。如果目标蛋白是有三级结构信息的，
这种表位预测+多肽免疫的成功率很高，一般在70%-80%以上。即便没有高级结构信息，
有经验的设计分析人员也可以将成功率控制在50%左右，一般而言选取2-3条多肽序列就
能至少有一个能制备出不错的抗体。我们这里有core facility专门提供这种服务，这
个技术本身应该说很成熟了。
自己原核表达纯化蛋白的部分片段自然也是一个选择，以前大部分人都不纯化而只是切
胶直接免疫，取决于你要做什么样的staining了，要求抗体特异性好的，就不建议这么
做了，光做western的话还凑合。 |
