v***a
发帖数: 1242 | 1 要克隆一个gene，发现用我自己培养的细胞来PCR扩增时，大部分P不出，少数P得出。
用别人养的相同的细胞，都P不出。凡是P出来的，会有两条靠得很近很近的条带（~1.
5kb）。
然后我就挖了上面的那一条下来，做成plasmid了，测序也都完全正确。
这次要做recombinant protein，所以重新设计了primer（PCR产物很短，只有600多bp
），用上次做的现成的plasmid进行PCR，结果又P出来两条很近的条带。
有点想不通，请教一下大家这是怎么回事呢？
另，做western blot时偶尔也出现靠得很近的条带（忽而又只有一条），没有见过有相
关isoform的报导。
谢谢！ |
a****d
发帖数: 1919 | |
v***a
发帖数: 1242 | 3 在plasmid中应该不会有这样的情况吧？
【在 a****d 的大作中提到】
: splicing?
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b******n
发帖数: 4225 | 4 自己配的那种loading dye，而且颜色棕红的，不是蓝色的？
bp
【在 v***a 的大作中提到】
: 要克隆一个gene，发现用我自己培养的细胞来PCR扩增时，大部分P不出，少数P得出。
: 用别人养的相同的细胞，都P不出。凡是P出来的，会有两条靠得很近很近的条带（~1.
: 5kb）。
: 然后我就挖了上面的那一条下来，做成plasmid了，测序也都完全正确。
: 这次要做recombinant protein，所以重新设计了primer（PCR产物很短，只有600多bp
: ），用上次做的现成的plasmid进行PCR，结果又P出来两条很近的条带。
: 有点想不通，请教一下大家这是怎么回事呢？
: 另，做western blot时偶尔也出现靠得很近的条带（忽而又只有一条），没有见过有相
: 关isoform的报导。
: 谢谢！
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D******t
发帖数: 79 | 5 That could be different isoforms. Why not clone the lower band and sequence
it? |
v***a
发帖数: 1242 | 6 不是啊，是蓝色的。这个loading dye会有影响吗？
【在 b******n 的大作中提到】
: 自己配的那种loading dye，而且颜色棕红的，不是蓝色的？
:
: bp
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v***a
发帖数: 1242 | 7 这是个好主意，下次试试。
另，isoforms到底是怎么回事呢，总是有点不甚了了，牛人能给解释一下吗？比方说我
这个例子，从plasmid是如何产生的。多谢！
sequence
【在 D******t 的大作中提到】
: That could be different isoforms. Why not clone the lower band and sequence
: it?
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b******n
发帖数: 4225 | 8 发现过用自己配的loading dye，如果pH没调整好
会引起DNA的电泳行为发生变化
比如本来1.2k，跑出来800bp
那种有双带的可以用商用loading dye上样重新跑一下
【在 v***a 的大作中提到】
: 不是啊，是蓝色的。这个loading dye会有影响吗？
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v***a
发帖数: 1242 | 9 多谢！我们这个应该是商用的，反正自己没配过，有公用的一个stock。
【在 b******n 的大作中提到】
: 发现过用自己配的loading dye，如果pH没调整好
: 会引起DNA的电泳行为发生变化
: 比如本来1.2k，跑出来800bp
: 那种有双带的可以用商用loading dye上样重新跑一下
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w***z
发帖数: 1158 | |
