d****u
发帖数: 1553 | 1 我有一点点转不过弯来。当进行shRNA 的genome wide screen的时候，最后要提取基因
组DNA然后PCR扩增hairpin
sequence为下一步无论是array还是sequencing做准备。这一步PCR怎么能保证扩增出来
的产物还在线性范围内呢，还是
有什么特殊的算法。有没有同学做过，给个提示啊。谢谢了先。 |
O******e
发帖数: 4845 | 2 你是不是想多了？一般不是提DNA做PCR then sequencing然后知道到底是哪个/些基因
被knock down么？
【在 d****u 的大作中提到】
: 我有一点点转不过弯来。当进行shRNA 的genome wide screen的时候，最后要提取基因
: 组DNA然后PCR扩增hairpin
: sequence为下一步无论是array还是sequencing做准备。这一步PCR怎么能保证扩增出来
: 的产物还在线性范围内呢，还是
: 有什么特殊的算法。有没有同学做过，给个提示啊。谢谢了先。
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d****u
发帖数: 1553 | 3 谢谢回复，你说的可能是针对单一基因的knockdown而不是针对screen的。做基因组级
别的pooled RNAi screen的时候，在筛选结束要抽基因组DNA。然后PCR扩增hairpin
sequence。再去上array或sequencing，就可以知道哪些hairpin富集了，哪些hairpin
减少了。 我问的是这一步，这时候因为所有的不同基因的hairpin都是混在一起的，所
以不可能得到特定基因的knock down水平 |
O******e
发帖数: 4845 | 4 我就是说的筛选。从genomic DNA －－ PCR是不会告诉你knock down efficiency的。
你还是准确说一下你的大概筛选策略和目的吧，不然就是空对空
RNAi
【在 d****u 的大作中提到】
: 谢谢回复，你说的可能是针对单一基因的knockdown而不是针对screen的。做基因组级
: 别的pooled RNAi screen的时候，在筛选结束要抽基因组DNA。然后PCR扩增hairpin
: sequence。再去上array或sequencing，就可以知道哪些hairpin富集了，哪些hairpin
: 减少了。 我问的是这一步，这时候因为所有的不同基因的hairpin都是混在一起的，所
: 以不可能得到特定基因的knock down水平
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O******e
发帖数: 4845 | 5 你这是在拼概率。
干嘛不去做个microarray，直接知道哪些基因的表达被下调，比你知道哪些hairpin被
富集直接多了。不过就是比较贵，呵呵
hairpin
【在 d****u 的大作中提到】
: 谢谢回复，你说的可能是针对单一基因的knockdown而不是针对screen的。做基因组级
: 别的pooled RNAi screen的时候，在筛选结束要抽基因组DNA。然后PCR扩增hairpin
: sequence。再去上array或sequencing，就可以知道哪些hairpin富集了，哪些hairpin
: 减少了。 我问的是这一步，这时候因为所有的不同基因的hairpin都是混在一起的，所
: 以不可能得到特定基因的knock down水平
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d****u
发帖数: 1553 | 6 策略大概是这样的，首先假定这是一个negative selection， 筛选marker是细胞的生
长速度。我们用一个pooled shRNA library（好比说有100K hairpins）去转染或感染
细胞。那么经过一段时间的细胞分裂之后（让我们假定一个月），有些hairpin会使细
胞增长加速，有些hairpin会延缓细胞生长。从表象上看就是在整个细胞群体中，有些
hairpin被富集了，有些被降低了。这时候就可以收细胞提DNA，然后PCR扩增hairpin
sequence。然后或者上array或者上nextgen sequencing。两者的read out都是hairpin
在整体中的丰度。然后再normalize to 第一天的data。就能算出哪些hairpin可以促进
或抑制细胞生长了。我的问题就是这时候做PCR如何保证整体里不同的hairpin是线性扩
增使得最后的read out能够进行比较。我的理解是这时候不管是array或sequencing都
不能让你知道在整个population里那个基因被knockdown了。而是告诉你你的这个DNA中
有哪些hairpin。 |
w********r
发帖数: 1431 | 7 我记得Scott W. Lowe有片筛选肝癌里tumor suppressor的cell就是这么干的，
不过没仔细看，不记得他的文章里有没有说这个问题。
但我觉得PCR效率应该影响不大，primer都是一样的，扩增的又都是shRNA的序列，而且
又很短。
现在的ChIP-Seq也都是加了adaptor扩增后去测序，似乎也没有考虑PCR效率的。
hairpin
【在 d****u 的大作中提到】
: 策略大概是这样的，首先假定这是一个negative selection， 筛选marker是细胞的生
: 长速度。我们用一个pooled shRNA library（好比说有100K hairpins）去转染或感染
: 细胞。那么经过一段时间的细胞分裂之后（让我们假定一个月），有些hairpin会使细
: 胞增长加速，有些hairpin会延缓细胞生长。从表象上看就是在整个细胞群体中，有些
: hairpin被富集了，有些被降低了。这时候就可以收细胞提DNA，然后PCR扩增hairpin
: sequence。然后或者上array或者上nextgen sequencing。两者的read out都是hairpin
: 在整体中的丰度。然后再normalize to 第一天的data。就能算出哪些hairpin可以促进
: 或抑制细胞生长了。我的问题就是这时候做PCR如何保证整体里不同的hairpin是线性扩
: 增使得最后的read out能够进行比较。我的理解是这时候不管是array或sequencing都
: 不能让你知道在整个population里那个基因被knockdown了。而是告诉你你的这个DNA中
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c******r
发帖数: 3778 | 8 明白了
这个是没有办法的事情。PCR扩增确实可能产生系统误差，但是目前没有办法完全消除
这个误差。当然楼上也说了，这么小的hairpin，又是唯一的primer，应该效率是差不
多的，这个系统误差应该不大。
所以这个PCR之后的只是筛选，挑出可能的candidate，然后还需要其他方法进一步确认
。比如你挑了10个candidates，可能只有3个被确认，也可能有9个被确认，这个就看你
下一步怎么弄了。
hairpin
【在 d****u 的大作中提到】
: 策略大概是这样的，首先假定这是一个negative selection， 筛选marker是细胞的生
: 长速度。我们用一个pooled shRNA library（好比说有100K hairpins）去转染或感染
: 细胞。那么经过一段时间的细胞分裂之后（让我们假定一个月），有些hairpin会使细
: 胞增长加速，有些hairpin会延缓细胞生长。从表象上看就是在整个细胞群体中，有些
: hairpin被富集了，有些被降低了。这时候就可以收细胞提DNA，然后PCR扩增hairpin
: sequence。然后或者上array或者上nextgen sequencing。两者的read out都是hairpin
: 在整体中的丰度。然后再normalize to 第一天的data。就能算出哪些hairpin可以促进
: 或抑制细胞生长了。我的问题就是这时候做PCR如何保证整体里不同的hairpin是线性扩
: 增使得最后的read out能够进行比较。我的理解是这时候不管是array或sequencing都
: 不能让你知道在整个population里那个基因被knockdown了。而是告诉你你的这个DNA中
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p*****y
发帖数: 44 | 9 你担心的是PCR效率问题。但是在做screen的时候，所有样品都是用同样的条件进行，
所以误差可以忽略。线性的问题主要决定于hairpin在不同样品里的浓度，以及你PCR的
循环数。最佳的条件当然是PCR Template在每个样品之间都一致，这样在同一个循环结
束。告诉你一个Trick,我都是先用Real-time PCR定量每个样品的hairpin浓度，然后调
整到每个样品一致。再根据Rreal-time PCR选择最后一个还大致处于线性扩增的循环结
束。因为Microarray, Sequencing都要很多PCR产物，做两轮PCR会更好。 |
