b****u
发帖数: 903 | 1 在revision，review建议endogenous的coip检验是否binding，表明真实的相互作用状态，我们文章里面，overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有成功，以前就看相关文献，一篇cell里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连overexpression这2个蛋白，我们也没检测到binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。 |
A******y
发帖数: 2041 | 2 Now you know how many over-expression data are probably wrong. Do you know
the binding site? How about introduces mutation at the binding interface
and see if you still can ip it down with over-experssion. |
w***a
发帖数: 1053 | |
s******s
发帖数: 13035 | 4 //nod, 检测有没有相互作用应该用这个呀，怎么能用co-ip
再说，就算有Interaction，co-ip也不一定work
【在 w***a 的大作中提到】
: GST-pull down
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a***e
发帖数: 1010 | 5 GST pull down is a more artificial assay, while co-IP more represents the
endogenous case.
【在 s******s 的大作中提到】
: //nod, 检测有没有相互作用应该用这个呀，怎么能用co-ip
: 再说，就算有Interaction，co-ip也不一定work
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O******e
发帖数: 4845 | 6 GST PD: direct interaction;
Co-IP: interaction, maybe indirect.
【在 a***e 的大作中提到】
: GST pull down is a more artificial assay, while co-IP more represents the
: endogenous case.
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C***Y
发帖数: 61 | 7
状态，我们文章里面，
overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有
成功，以前就看相关文献，一篇cell
里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连
overexpression这2个蛋白，我们也没检测到
binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。
Hopefully these tips will be helpful.
Make sue you have a very good 1st antibody. A strong antibody is capable of
pulling down weak interaction
partners.
Crosslink 1st antibody to beads and elute co-purified protein complex from beads
after washing (instead of boiling
beads) to reduce background.
Use ECL plu
【在 b****u 的大作中提到】
: 在revision，review建议endogenous的coip检验是否binding，表明真实的相互作用状态，我们文章里面，overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有成功，以前就看相关文献，一篇cell里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连overexpression这2个蛋白，我们也没检测到binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。
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v***a
发帖数: 1242 | 8 我也有类似的co-ip不work的困扰。
请问你说的：
“Crosslink 1st antibody to beads and elute co-purified protein complex from
beads after washing (instead of boiling beads) to reduce background”
怎么个crosslink法？我是加了1st Ab overnight再加beads的。
还有elute我是用的SDS sample buffer，然后就boil，100 C，10min。boiling beads
和elute是两个独立的过程呀，为啥elute可以取代boiling？是我理解错你的意思了吗？
关于ECL plus，我觉得用ECL曝光久一点，貌似也跟plus一样的效果，而且plus还会令
blot颜色深浅不均一，不知道你会有这个问题吗？如果有，怎么解决比较好？
谢谢回答。
of
【在 C***Y 的大作中提到】
:
: 状态，我们文章里面，
: overexpression可以检测到binding，但内源的试了几次，摸索了不同buffer条件没有
: 成功，以前就看相关文献，一篇cell
: 里面可以内源检测到该蛋白和一个底物binding，但我们没有重复出来，就连
: overexpression这2个蛋白，我们也没检测到
: binding，哎，十分frustrated啊，coip就是很tricky。
: Hopefully these tips will be helpful.
: Make sue you have a very good 1st antibody. A strong antibody is capable of
: pulling down weak interaction
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C***Y
发帖数: 61 | 9
from
beads
吗？
Here are the details:
Incubate 1at Ab with beads for 1 hr at RT. Wash away the unbound Ab.
Crosslink Ab to beads with Imidoester
Crosslinkers (Pierce). Incubate Nuclear extract (or whole cell lysate) with
beads-Ab.
After washes, elute the co-purified protein complex with low PH glycine
solution instead of boiling beads.
【在 v***a 的大作中提到】
: 我也有类似的co-ip不work的困扰。
: 请问你说的：
: “Crosslink 1st antibody to beads and elute co-purified protein complex from
: beads after washing (instead of boiling beads) to reduce background”
: 怎么个crosslink法？我是加了1st Ab overnight再加beads的。
: 还有elute我是用的SDS sample buffer，然后就boil，100 C，10min。boiling beads
: 和elute是两个独立的过程呀，为啥elute可以取代boiling？是我理解错你的意思了吗？
: 关于ECL plus，我觉得用ECL曝光久一点，貌似也跟plus一样的效果，而且plus还会令
: blot颜色深浅不均一，不知道你会有这个问题吗？如果有，怎么解决比较好？
: 谢谢回答。
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v***a
发帖数: 1242 | 10 非常感谢
还有2个问题：
1）你是用什么buffer来incubate 1st Ab 和 beads的？跟wash一样的buffer吗？我
wash是用IP lysis buffer。你会preclean nuclear extract/cell lysate吗？
2）low pH glycine solution具体是多low？6.8？这个是可以直接elute然后
centrifuge了就可以上样跑胶？
with
【在 C***Y 的大作中提到】
:
: from
: beads
: 吗？
: Here are the details:
: Incubate 1at Ab with beads for 1 hr at RT. Wash away the unbound Ab.
: Crosslink Ab to beads with Imidoester
: Crosslinkers (Pierce). Incubate Nuclear extract (or whole cell lysate) with
: beads-Ab.
: After washes, elute the co-purified protein complex with low PH glycine
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C***Y
发帖数: 61 | 11
PBS or washing buffer can be used for incubating Ab with beads;
I have never done preclear;
Glycine solution (pH~2.8) can be used for elution. After elution, add equal
volume of 1 M Tris, PH7.5 (for
neutralization) and equal volume of 3 X SDS loading buffer.
【在 v***a 的大作中提到】
: 非常感谢
: 还有2个问题：
: 1）你是用什么buffer来incubate 1st Ab 和 beads的？跟wash一样的buffer吗？我
: wash是用IP lysis buffer。你会preclean nuclear extract/cell lysate吗？
: 2）low pH glycine solution具体是多low？6.8？这个是可以直接elute然后
: centrifuge了就可以上样跑胶？
:
: with
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b****u
发帖数: 903 | 12 多谢各位的建议，crosslink我也曾经try过，就是重复不了别人的实验，人家内源也可
以pulldown，咱们overexpressing都不行，差距那叫一个大啊。
BTW，可能不同lab做COIP的时候的buffer条件不一样吧。 |
v***a
发帖数: 1242 | 13 多谢多谢！
equal
【在 C***Y 的大作中提到】
:
: PBS or washing buffer can be used for incubating Ab with beads;
: I have never done preclear;
: Glycine solution (pH~2.8) can be used for elution. After elution, add equal
: volume of 1 M Tris, PH7.5 (for
: neutralization) and equal volume of 3 X SDS loading buffer.
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b*******H
发帖数: 830 | 14 pH2.8 PLUS 1/20 V of pH9.4, or pH3.5 elution plus 1/10 V of pH8.5 could be
better. otherwise, sample going to be diluted too much.
remember doing it at RT, and no more than 15min.
equal
【在 C***Y 的大作中提到】
:
: PBS or washing buffer can be used for incubating Ab with beads;
: I have never done preclear;
: Glycine solution (pH~2.8) can be used for elution. After elution, add equal
: volume of 1 M Tris, PH7.5 (for
: neutralization) and equal volume of 3 X SDS loading buffer.
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b*******H
发帖数: 830 | 15 THERMO 的Femto 可比普通的ECL灵敏1000倍，平常曝白片的膜换上FEMTO经常是肉眼下
熠熠发光啊，但对有些抗体不行，背景太高。
另外就是世纪太贵。
from
beads
吗？
【在 v***a 的大作中提到】
: 我也有类似的co-ip不work的困扰。
: 请问你说的：
: “Crosslink 1st antibody to beads and elute co-purified protein complex from
: beads after washing (instead of boiling beads) to reduce background”
: 怎么个crosslink法？我是加了1st Ab overnight再加beads的。
: 还有elute我是用的SDS sample buffer，然后就boil，100 C，10min。boiling beads
: 和elute是两个独立的过程呀，为啥elute可以取代boiling？是我理解错你的意思了吗？
: 关于ECL plus，我觉得用ECL曝光久一点，貌似也跟plus一样的效果，而且plus还会令
: blot颜色深浅不均一，不知道你会有这个问题吗？如果有，怎么解决比较好？
: 谢谢回答。
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