c*********r
发帖数: 1312 | 1 和大家讨论一些实验的问题
背景：老板要一个融合蛋白，本来在海胆（Sea Urchin）里表达的，分子量~85KDa，叫
Dishevelled，至少有磷酸化的修饰，在Wnt pathway里很重要一蛋白。想和一个tag连
在一起，其实最主要的是想得尽可能多的有正确修饰、折叠的天然蛋白用来做Far-
western blotting研究蛋白相互作用。可是我们都没有表达真核蛋白的经验，用E.
coli肯定不行。in vitro转录可能表达量不够，做一个Far-Western Blotting要1~50
μg的蛋白用量，而且指不定得做多少次来摸条件和重复呢。
要求：1.正确的修饰、折叠等等；2. 表达量大
问题：1. 用什么kit，细胞可以达到以上要求？有人推荐老板用昆虫细胞。
2. 自己做还是找公司做？我倾向于找公司或lab合作做但不知道有哪些公司可以做。大
家推荐一下吧。想合作也可以，嘿嘿。
多谢！ |
s******y
发帖数: 28562 | 2 可以用酵母或者昆虫。酵母表达很容易，但是产量很低。
昆虫细胞表达高，其实也挺容易的，但是没有经验的话会弄不明白。而且从头
建立一个昆虫表达系统还是很麻烦的
如果你们没有经验，那就找别的实验室来合作吧，
我推荐两个实验室：
MD Anderson Cancer center, Texas, Sue-hua Lin
Univ of Guelph, Canada, John Dawson
他们两个实验室都经常用昆虫细胞表达蛋白。不过他们都是做研究的实验室，
不是专门的表达中心，所以会不会跟你们合作是未知数。 如果他们对你们的
项目很感兴趣的话，可能会帮忙，不然就不一定了。找他们表达的好处是
一般是不收钱的（合作项目嘛）
公司我就不知道了，应该是有的，但是可能不便宜。
【在 c*********r 的大作中提到】
: 和大家讨论一些实验的问题
: 背景：老板要一个融合蛋白，本来在海胆（Sea Urchin）里表达的，分子量~85KDa，叫
: Dishevelled，至少有磷酸化的修饰，在Wnt pathway里很重要一蛋白。想和一个tag连
: 在一起，其实最主要的是想得尽可能多的有正确修饰、折叠的天然蛋白用来做Far-
: western blotting研究蛋白相互作用。可是我们都没有表达真核蛋白的经验，用E.
: coli肯定不行。in vitro转录可能表达量不够，做一个Far-Western Blotting要1~50
: μg的蛋白用量，而且指不定得做多少次来摸条件和重复呢。
: 要求：1.正确的修饰、折叠等等；2. 表达量大
: 问题：1. 用什么kit，细胞可以达到以上要求？有人推荐老板用昆虫细胞。
: 2. 自己做还是找公司做？我倾向于找公司或lab合作做但不知道有哪些公司可以做。大
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c*********r
发帖数: 1312 | 3 多谢多谢！多方打听后准备用昆虫细胞表达。先自己看看文章和这本书（http://www.sciencedirect.com/science?_ob=PublicationURL&_tockey=%23TOC%2318066%232009%23995369999%231553090%23FLA%23&_cdi=18066&_pubType=BS&_auth=y&_acct=C000038378&_version=1&_urlVersion=0&_userid=687815&md5=7730b91bf58e8c41c7ee53569b79f494），有点概念之后和一些实验室联系联系看怎么做可行，合作当然做好不过了。
又是一个艰巨的任务啊。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 可以用酵母或者昆虫。酵母表达很容易，但是产量很低。
: 昆虫细胞表达高，其实也挺容易的，但是没有经验的话会弄不明白。而且从头
: 建立一个昆虫表达系统还是很麻烦的
: 如果你们没有经验，那就找别的实验室来合作吧，
: 我推荐两个实验室：
: MD Anderson Cancer center, Texas, Sue-hua Lin
: Univ of Guelph, Canada, John Dawson
: 他们两个实验室都经常用昆虫细胞表达蛋白。不过他们都是做研究的实验室，
: 不是专门的表达中心，所以会不会跟你们合作是未知数。 如果他们对你们的
: 项目很感兴趣的话，可能会帮忙，不然就不一定了。找他们表达的好处是
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r****r
发帖数: 379 | |
