m****m
发帖数: 395 | 1 最近提纯一个HIS-TAG的蛋白，试了很久就是不是一条带，一直以为是杂带没有清除，
后来感觉不对劲，好像就是它本身。但是很奇怪，如果是这个蛋白的二聚体、三聚体等
，应该是跑在整数倍的线上啊，但是不是，可这些条带又是线性有规则地排开的。还有
，有时候同一条带上的一条蛋白会分裂，就是靠得非常近，但是仔细看是分裂的。有谁
能帮我解释一下为什么会跑出这种胶的结果来吗？同一个蛋白构象不同，条带也会不在
一个地方吗？ |
h**2
发帖数: 2841 | 2 post-translational modification
phosphorylation
glycosylation
etc.
depending on your project, it may be very important for functional
investigation or may be not so relevant and you can look back later.
【在 m****m 的大作中提到】
: 最近提纯一个HIS-TAG的蛋白，试了很久就是不是一条带，一直以为是杂带没有清除，
: 后来感觉不对劲，好像就是它本身。但是很奇怪，如果是这个蛋白的二聚体、三聚体等
: ，应该是跑在整数倍的线上啊，但是不是，可这些条带又是线性有规则地排开的。还有
: ，有时候同一条带上的一条蛋白会分裂，就是靠得非常近，但是仔细看是分裂的。有谁
: 能帮我解释一下为什么会跑出这种胶的结果来吗？同一个蛋白构象不同，条带也会不在
: 一个地方吗？
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b******n
发帖数: 4225 | 3 在什么宿主上提纯出来的？
E.coli, yeast，insect or mammalian cell?
【在 m****m 的大作中提到】
: 最近提纯一个HIS-TAG的蛋白，试了很久就是不是一条带，一直以为是杂带没有清除，
: 后来感觉不对劲，好像就是它本身。但是很奇怪，如果是这个蛋白的二聚体、三聚体等
: ，应该是跑在整数倍的线上啊，但是不是，可这些条带又是线性有规则地排开的。还有
: ，有时候同一条带上的一条蛋白会分裂，就是靠得非常近，但是仔细看是分裂的。有谁
: 能帮我解释一下为什么会跑出这种胶的结果来吗？同一个蛋白构象不同，条带也会不在
: 一个地方吗？
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n*********g
发帖数: 47 | 4 多半是没有加还原剂，加点BME.
【在 b******n 的大作中提到】
: 在什么宿主上提纯出来的？
: E.coli, yeast，insect or mammalian cell?
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n********e
发帖数: 1630 | 5 agree... nor totally reduced
【在 n*********g 的大作中提到】
: 多半是没有加还原剂，加点BME.
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m****m
发帖数: 395 | 6 这次加了BME了，还是有这个现象，明明是同一个蛋白，在不同泳道上，却跑得一前一
后，虽然间隔极近，几乎就快要一直线了，但是还是有明显的前后。我用FPLC分离的，
看曲线分段取样，然后跑在不同的道上，其实肯定是同一个东西，条带很深，杂蛋白不
带HIS-TAG，之前WASH步骤应该就洗掉了，不可能结合得那么牢，最后ELUTE的时候下来
一大堆，肯定是样品，但是不知道为什么还是这样。或者跟上样量也会有关吗？比如上
得多会跑得慢点？
我是提纯了用来测结构的，所以希望尽可能纯。 |
m****m
发帖数: 395 | |
n*********g
发帖数: 47 | 8 maybe not enough? Or some other reason.
【在 m****m 的大作中提到】
: 这次加了BME了，还是有这个现象，明明是同一个蛋白，在不同泳道上，却跑得一前一
: 后，虽然间隔极近，几乎就快要一直线了，但是还是有明显的前后。我用FPLC分离的，
: 看曲线分段取样，然后跑在不同的道上，其实肯定是同一个东西，条带很深，杂蛋白不
: 带HIS-TAG，之前WASH步骤应该就洗掉了，不可能结合得那么牢，最后ELUTE的时候下来
: 一大堆，肯定是样品，但是不知道为什么还是这样。或者跟上样量也会有关吗？比如上
: 得多会跑得慢点？
: 我是提纯了用来测结构的，所以希望尽可能纯。
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