w******e
发帖数: 1187 | 1 thx for sharing.这倒是一个新思路，跟ruoslahti最近一篇science有点像。
不过蛋白酶的位点有很diverse吗？他们又要做basic science（validation of
protease
as cancer biomarker）又要做应用的话还挺苦的。不用Ab，总需要什么其他的
affinity
agent吧？
有没有相关paper推荐一下？thx~ |
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Z******5
发帖数: 435 | 2 多搞点样品，分成两份。
一份拿DNA酶处理后，（跑双向分开？），做MS spec
另一份可以考虑按照ChIP 的protocol，用蛋白酶，RNase等处理，收集DNA。 |
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d********e
发帖数: 81 | 3 实验需要抽取受试者血液并测定血浆荷尔蒙含量，需要在离心前加入APROTININ。如果
购买纯品（粉末）自己配制，需要什么做溶剂？各物质终浓度为多少最佳？谢谢。。。
新年快乐！ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 4 我就是用的BL21(DE3)pLysS strain，用0.4mM的IPTG诱导，表达4hr，蛋白产量很好。
T7 lysozyme是T7 RNA polymerase的natural inhibitor，它的表达是为了抑制在BL21(
DE3)里比较常见的leaky expression，但是这个表达量不至于抑制被IPTG诱导后的
expression。而且lysozyme不是蛋白酶，不可能降解你的蛋白。
你的蛋白如果用BL21(DE3)表达很好，说明你的蛋白对E.coli没有细胞毒性，你可以不
需要用BL21(DE3)pLysS来表达。
还有就是你看一下你用的是BL21系列还是BL21 Gold系列，这两个系列都有(DE3)和(DE3
)pLysS，但是我用BL21 Gold系列就碰到过表达不出来的问题。我说的BL21和BL21 Gold
都是Stratagene（现在的Agilent Genomics）的产品，不知道别的公司是不是也是这么
标识的。 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 6 PMSF 太毒了，不想用，市面上的一些cocktail效果又不是很好 |
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c*********r
发帖数: 1312 | 7 世面上的cocktail你试过哪几家的，怎么判断不好？我以前是自己配，现在用Pierce的
，100X，使用很方便，但是不知道如何判断效果好不好。SDS page的条带很sharp算效
果好吗？^_^ |
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a*********n
发帖数: 2526 | 8 看介绍，这个inhibitor 还不错，试试看了，谢谢 |
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n***w
发帖数: 2405 | 9 嗯。我们也用pierce的protease inhibitor cocktail～ |
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h*******n
发帖数: 2052 | 10 how about the one from Sigma P8340? |
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h*******n
发帖数: 2052 | 11 I am using DFP, much much much more toxic than PMSF.
55555........... |
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a*********n
发帖数: 2526 | 12 PMSF 见血封侯，沾到白大褂上都得扔，难道DFP是传说中的含笑半步颠？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 13 PMSF有这么严重吗？
只是觉得溶剂比较容易挥发。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 15 有那么夸张吗？我沾到PMSF不知道多少次了，不也活得好好的。。。 |
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a*********n
发帖数: 2526 | 17 只是夸张的说一下，不过的确很毒，很多年前就听说过，acetylcholine esterase
inhibitor， 很容易穿过皮肤。毒不毒看一下safety data sheet 就知道了。 |
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d*******d
发帖数: 1341 | 18 我看了看，PMSF毒性3接触4，确实很毒了啊。谢谢楼主吓唬，以后注意点 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 19 15-20%的甘油即可，50%太夸张了
膜蛋白其实对冻融过程抵抗能力更强一些，但是我不太同意37度解冻，不知多少蛋白酶
会happy的不得了，我一般自来水冲
其实最好先低（1kG，取上清）后高（>50kG，取沉淀）把膜提出来再冻，干净得多 |
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s*********t
发帖数: 600 | 20 一公时代的到来
一公时代的到来，指的是清华大学生命科学院、中国的结构生物学史上施一公时代的到
来。借着清华大学百年校庆，这
两天在清华举办的FPS（Frontiers of Protein Sciences）会议作为醒目的标志，给大
家展示了施一公教授的能力与魅
力。一公时代的大幕朝每一个与会者闪亮的拉开。
这段话写的是如此的像托，像清华生科院给媒体的公关文，但这确实是我这次会议的切
身感受，容我一一道来。
施一公教授从2008年回清华组建实验室到现在，满打满算三年。三年对于一个挪窝的人
来说，是短暂的，结束那边的事
情，迎接这边的事情，科研上的行政上的生活上的麻烦不会少，而且还有方/舟/子对他
有理有据的质疑。这种日子肯定
不会好过，他是怎么过的，我不知道，我所知道的是我们大家都能看到的。
科研上。饶毅教授下过结论：施一公教授是华人里发表CNS文章最多的人。这指他在
Princeton的时候，回来以后呢？会
议上发的介绍里，施一公教授从09年到11年的selected publications共11篇，Cell两
篇，Nature四篇，Science一
篇，PNAS两篇，Mol ce... 阅读全帖 |
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j****x
发帖数: 1704 | 21 缺乏小动物模型直至今日也依旧如此，但是早已不缺乏体外细胞培养系统了。这个难题
在2006年左右被突破，随后几件逐步完善，目前已经广泛应用于药物筛选评价。当然，
在这个药物最开始研发的时候，该系统并未完全建立了，不过那个时候还是有基于蛋白
酶活力检测的indirect assay来评价蛋白酶抑制剂，早期HIV药物删选走过的老路。基
于这些细胞模型的方法得到几个候选也已经到了phase II了，怎么说呢，这个
Boceprevir比较鼓舞也确实是很幸运的事情。 |
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k******n
发帖数: 133 | 23 Useful for antibody characterization. |
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M*****3
发帖数: 259 | 24 代一gg问发帖问这个问题！问题如下：
“如何稳妥quit PHD
小弟生物phd第一年，做蛋白酶方向，一年下来觉得前途渺茫，也不想在这里继续了，
不多解释，你懂的。
现在手里有商科offer一枚，不知道如何跟boss quit.如果转校release I20, boss 一
定会知道吧，很担心他会不会到新学校把offer搞掉。
望各位过来人给点拨一二，小弟在此谢过了。” |
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j**u
发帖数: 5 | 25 我现在检测一个基因敲除小鼠大脑中的一些蛋白，发现某些蛋白的磷酸化水平和对照小
鼠相比，在有的敲除小鼠是增加的，在有的敲除小鼠中是减少的，而且都很明显。请问
这可能是什么原因造成的呢？提蛋白的时候蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂都加了的。谢
谢大家！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 当然是稀释比较好，除非是某些需要很长时间才能交换出来的离子或者小分子。
透析的时候时间放得太长，蛋白会变性，一方面是因为你用的buffer 怎么着
也不是细胞内部的native buffer, 另外一方面，即使你用了还原剂，
也挡不住一些氧化反应，第三，extract中会有被释放出来的蛋白酶。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 27 哎，大家怎么这么喜欢较真啊。我说的那个4度变性是指那个总蛋白的抽提物。
里面有各种各样的蛋白酶什么的，在4度里面，你再加什么抑制剂也挡不了
它们慢慢起作用，再加上氧化反应。。。
而纯化后的蛋白一般都没有那些杂七杂八的东西，而且都是保存在适合的
缓冲液里面的，而且是在密封的管子里的。当然不会那么容易变性。
但是假如把一个细胞总蛋白随便的放在某个不三不四的缓冲液里面，
然后把盖子掀开透气，4度放过夜之后应该会沉淀了吧？
当然，透析的时候，总会有一些蛋白因为盐析的原因，或者和透析膜有各种接触，
而沉淀的。不过这个具体到底是什么原因我似乎没有看见有人去分析过。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 MG132 在10uM 以上对proteasome抑制很明显。有些好的杂志不接受这个作为
单独证据是因为MG132 对很多其他蛋白酶也有抑制作用，所以需要其他证据
一起来confirm. 但是这个并不是你的问题的所在处。
你的情况下，你用6ohda 处理细胞有多久？用MG132又有多久？
另外，你的蛋白并不一定就是降解，有另外几种可能，一个是表达减少，
另外一个是分泌出去了。 |
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A****a
发帖数: 18 | 29 Larva里有很多蛋白酶，可能消化了你的目标蛋白。 |
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m*****u
发帖数: 15526 | 30 新华社伦敦9月19日电(记者黄堃)在网上玩玩游戏就可以在著名的英国《自然》系列学
术刊物上发表论文？这听起来非常不可思议，但《自然·结构和分子生物学》杂志近日
发表了这样一篇有网络游戏玩家署名的论文：《蛋白质折叠游戏玩家揭示一种单分子逆
转录病毒蛋白酶的晶体结构》。 www.6park.com
文中提到的蛋白质折叠游戏名为Foldit，是美国华盛顿大学研究人员开发的一款具
有浓厚科学色彩的网络游戏。游戏玩家要做的是，在给定一个目标蛋白质后，在遵守科
学规律的前提下，用氨基酸如搭积木一样把目标蛋白质“搭建”出来。 www.6park.com
玩这个游戏其实不需要太多科学知识，只要遵守预先设定的规则就行。玩家每次游
戏成功都可获得积分，提升自己在游戏世界的知名度，碰到难题时还可以在网上和其他
玩家交流。 www.6park.com
此次被破解结构的蛋白质名为M-PMV，是一种与猴类艾滋病病毒有关的蛋白质。科
研人员一直没能探明它的具体结构。华盛顿大学研究人员于是把这个蛋白质设为目标，
放入Foldit游戏中。没过多久，就有玩家找出了可能的氨基酸组装方式。 www.6park.
com
华盛... 阅读全帖 |
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f*******e
发帖数: 354 | 31 信号肽的切除是蛋白酶体途径？ 我不懂这个
怎么看是否有信号肽，预测？或有特征氨基酸谱？
谢谢 |
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f*******e
发帖数: 354 | 32 信号肽的切除是蛋白酶体途径？ 我不懂这个
怎么看是否有信号肽，预测？或有特征氨基酸谱？
谢谢 |
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s*******e
发帖数: 1010 | 33 在你蛋白的C末端终止密码子之前加进两个限制性酶切位点，然后把你的补加的linker
和tag设计成引物。即使十六氨基酸加上十个His也就26×3=78个bp再加上两头的酶切位
点6×2=12和保护碱基四个，总共才不到100个碱基。设计两条长度60bp的引物在中间有
20bp的互补区域就正好能覆盖100个bp。放在一起退个火再延伸一个回合，把产物连到
你蛋白的C-末端就成了。
我觉得这个其实不是连多长的tail的问题，换tag可能更好。你可以连接一个GST或着
GFP到你蛋白的C末端，如果用GFP的话再把His连到GFP的C末端。这个融合蛋白如果能表
达就一定能亲和纯化。在两个蛋白之间加上一个蛋白酶切位点就有机会在纯化后切出你
的蛋白来。
另外，Hisx6已经不fashion了，要X8或者X10才能hold住场面！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 in vitro translation 无法排除外源酶的作用。因为cell extract 里面有
不少蛋白酶是除不掉的。 |
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k******0
发帖数: 1073 | 35 如果有protease活性，可以试一试各种抑制剂，看看属于哪类的酶，在制备中添加相应
的抑制剂。
印象中蛋白酶还是较容易被抑制的。 |
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D******9
发帖数: 2665 | 36 从ECOLI纯化的蛋白没有办法完全避免污染， 可以考虑做一个不同梯度的稀释试验，
然后看那两个蛋白的比率， 要是有外援蛋白酶污染， 经过稀释， 那个小蛋白的比例
应该会降低。 要是那个是自切， 比例应该不会大变 |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 呵呵，学生的活要是交给我来做肯定是我做得更快。但是我们的活不像你们的，
你们的是程序，我们的是活细胞或者蛋白酶，不太好转手来转手去的，如果是
学生在做着，就只能由着他／她做了，不合适让我们中间接手的。如果发现
出了问题要找原因，一般也就是让他／她从头做一遍让我在一旁盯着看，而且
也不像你们编程的可以找到一个肯定的原因。有时候我们出了错也是莫名其妙的，
比方说我带的小姑娘有时候会出一些匪夷所思的奇怪的数据（明显是错误的数值），
但是我还就是找不到她到底操作的时候错在哪里了。
的。 |
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o****u
发帖数: 214 | 38 是，常见的都是识别位点前序列的。
我就是想知道有没有识别位点后序列的。
也就是说S1,S2,S3,S4 pocket非特异，而S1',S2',S3'pocket特异的 |
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b**********8
发帖数: 349 | 39 如题，最好详细点的，特别是蛋白酶K消化的lysis buffer配方能否详细介绍下，多谢 |
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w******n
发帖数: 767 | 40 好像有人用NAOH裂解,再加HCl中和，连蛋白酶K都不用。 |
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l***g
发帖数: 19 | 41 也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了 |
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W*********e
发帖数: 247 | 42 GST可以二聚, 有可能是二聚促进了pulldown和酶活. :)
但是没理由6p3载体表达出来的比5的少, 还降解
也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了 |
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k********n
发帖数: 136 | 43 有个系的老鼠要做ｑＰＣＲ鉴定转基因是杂合子还是纯合子．
方法１ 尽量把尾巴剪得一样长，用蛋白酶Ｋ消化后，用乙酸氨沉淀蛋白，再用异丙醇
或乙醇沉淀，都是浑浊的雾状，消化好的，可以看到螺旋絮状ＤＮＡ，但ｑＰＣＲ结果
不好．
方法２ ＮａＯＨ消化后，Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中和，离心直接ｑＰＣＲ．
两个方法好像结果的变异都比较大，有时候很难区分１ｃｏｐｙ和２ｃｏｐｙ．
大侠们觉得我哪里做的有问题呢？ 先谢谢了 |
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b**********8
发帖数: 349 | 44 最近开始做这个实验，大概流程如下，RSB+0.5% NP-40 分离nuclei，然后用NEB 公司
的 DNase I （浓度分别为0,8,16,32,64,128 Units/ml）在37度切25min，加EDTA(
final conc 5mM)混合后75度10min终止反应，蛋白酶k 56度过夜消化，酚氯仿抽提。取
2ug 基因组DNA跑0.8% TBE 胶，理论上随着DNase I 酶量加大，应该能看到一个DNA逐
渐变碎的过程，可是我做了几次，都只看到一个很微弱的趋势，我现在有两个问题想请
教大家，
1）是否一定要在DNase I 处理后看到一个明显的基因组DNA变碎的趋势？
2）NEB网站上建议的DNase I处理完毕后需要加一定量的的EDTA，再75度10min，但是我
看别的文献里说EDTA是用来保护mRNA不受降解的，适用于做reverse transcription之
前去处RNA样品中残留的基因组DNA。我这个实验里需呀尽量除去RNA，是否可以不加
EDTA而直接做heat inactivation？
请大家帮助，谢谢 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 45 if 尿激酶: by small-angle X-ray scattering paper:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21669207
if 丝氨酸蛋白酶 you also hlod antibody of it,
then try by Surface Plasmon Resonance Analysis (SPR)
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19047064 |
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d***y
发帖数: 8107 | 46 【 以下文字转载自 Returnee 讨论区 】
发信人: irving (当我数到三 我听到隔壁有人自楼上跳下), 信区: Returnee
标 题: 美国助理教授因为爱情而海龟
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Mar 20 17:25:30 2012, 美东)
http://news.sciencenet.cn/htmlnews/2012/2/259362.shtm
在美国学习、研究10余年，获得了终身制的教职，买了房，定了居，唐淳实现了所谓的
“美国梦”。但一场“万里一线牵”的爱情让他改变了自己的“运动轨迹”,把他“牵
”回了祖国。
唐淳：中科院武汉物理与数学研究所博士生导师。1998年获浙江大学生物学学士，2003
年获美国马里兰大学生物化学博士，2003至2007年在美国国立医学中心糖尿病、消化及
肾脏疾病国家研究院从事博士后研究，2008年至2009年在美国密苏里大学生物化学系任
终身制助理教授，2009年12月入选中科院“引进海外杰出学者计划（百人计划）”回国。
主要研究方向为溶液核磁共振、生物物理和结构生物学，多年从事生物大分子核磁的新
方法及应用研究，建立和... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 这种情况其实不普遍。
另外，如果融合上的蛋白是被各种蛋白酶来降解的话，的确常常会留下一个孤零零的
GFP, 但是如果是被proteasome 降解的话一般会把GFP也同时降解了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 49 呵呵，这个不是我夸口，我们实验室（至少我们这一代几个博士后里面）的文章，
关键数据都是可以重复的。也许在一些具体细节上，比方说老鼠器官在什么
时候开始出现症状，什么时候会死掉，不同实验室做出来会有点差别（这个在老鼠里面
是正常的波动），但是最后会出现哪些症状是没有问题的。
我们还发了不少生化文章，可以很坦然地说，只要你照着里面的方法，用我们给你的细
胞系和正确测序了的质粒，最后作出来的结果肯定是和我们作出来的相似的。
我自己的那片一作文章（生化类），在发出来后几个月之内，就有个牛校的人写信告诉
我们他们一年前曾经用不同的方法作出来和我们类似的结论，但是因为他们不是做我们
这行的所以没有跟着深入做下去（所以当然也没有发表出来）。所以在这个意义上，我
们的结论已经被别人重复了（或者说我们重复了他们的结论）
唯一能够质疑我们的文章意义的，就是我们用的是重组蛋白，和体内的原始蛋白可能不
完全一致，这个倒是目前没有办法解决的问题，其实也是整个生化领域里面大部分实验
设计的问题。比方说我们做的蛋白酶，你不加个tag就很难纯化，加了就有一个是否会
改变蛋白活性的风险（tag 是没有办法完全切掉的，怎... 阅读全帖 |
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s******l
发帖数: 7 | 50 最近做一个丝氨酸蛋白酶的降解底物的活性实验，发现在低浓度的时候有活性，能够在
30分钟内将底物降解完全，而在高浓度（是低浓度的50倍）时活性受到抑制，底物完全
不被降解。想请教各位，这种现象该如何解释。谢谢！ |
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