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t*****3
发帖数: 878 | 2 【 以下文字转载自 Dreamer 讨论区 】
发信人: Dreamer (不要问我从哪里来), 信区: Dreamer
标 题: 求助！实在是走投无路了！
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Dec 28 04:35:31 2012, 美东)
本人千老一名。最近实在是被折腾的走投无路了，想借助大家的思路，看看我这个情况
怎么办。最近几个月的实验总是出问题。我培养的细胞前一段时间总是被污染，好了一
段时间后最近开始大批的死亡，而且死得很怪异。比如一盘24孔板的细胞，有的死有的
长得很好。要是说是技术问题的话，一样的细胞一样的培养液怎么会有的死掉有的好好
的，还有就是基本上比较耗时间的实验的细胞全死光了，而且就是在关键的时间点上。
最主要的是细胞大批连续发生2次了，我和我们实验室的technichian们还有几个要好的
薄厚们讨论了一下都觉得不可能是我的实验技术有问题。我们一致怀疑是有人搞破坏，
因为不光是细胞大批死亡，还有就是westernblot也被人搞破坏，具体就不说明怎么被
破坏的了。我们怀疑的那个人是去年刚招的薄厚，是个中国人。他刚来实验室的时候我
帮了他不少，还把自己的... 阅读全帖 |
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c******t
发帖数: 108 | 3 求助啊~siRNA转染组比对照组有更高的目的基因的表达 （大概高30-40%），且统计学
上P<0.01.
完全按照protocol来，应该没标错样品，转染了2天后，换成正常的培养液，再过2天，
收了细胞，提了RNA，做了PCR。怎么会这样？
有没有可能siRNA在转染4天后就失效了？转染组细胞为了弥补之前的“被抑制”，就更
多的表达目的基因？
谢谢大侠们！ |
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W*******n
发帖数: 2762 | 4 细胞用的，用his-tag在c terminal, 已经建立在stable cell (HEK 293),直接分泌到
胞外，然后收培养液提纯，但表达效率不高。
如果transient expression, 就麻烦。不知道有人比较过没有？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 5 这是一个可能性。
但是还有另外一个可能性就是他们添加cycloheximide的时候不是直接加入原有的培养
液中，而是新配了一个含有cycloheximide的培养液然后给细胞换液，这个就会导致细
胞在30分钟到一个小时之内会出现蛋白上升的现象。这个是很多不专门做蛋白降解的实
验室都会出现的操作错误。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 7 20个小时太长了！很多正常细胞都死了，活下来的很多都是怪胎。
一般我对这种实验的处理都不超过9个小时。
另外，注意看我上面的回复，要提前一天换液。加药品处理的当天不要加新培养液。 |
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c*******7
发帖数: 314 | 8 但是如果是测试药物，要测试pathway recover是否是因为新蛋白的合成，还是因为
compound失效了，那么做washout-/+CHX，这种情况不可能不换新的培养液啊 |
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s******y
发帖数: 28562 | 9 当然了 :)
就是为了让使用者自行控制里面的氨基酸的。
除了SILAC, 还有用S35-Methione 做translation labeling 的时候也会使用到类似的
培养液。但是因为市场很小，所以生产成本高 |
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F****y
发帖数: 112 | 11 我一直在研究配方，而且积累了一些了，想找高手讨教啦，不知道这里有哪些高人可以
赐教。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 13 小提和中大提的培养液量不同，生长曲线不一样。
建议要么在中大提培养的时候增加抗生素用量，要么你就摇上１０～２０个小提的管，
然后合在一起做中提
number |
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s******y
发帖数: 28562 | 14 对，你说的非常好。关键就是这个接种方法不同。小提一般都是从板上的菌点接种，
而中提是在已经长起来的液体里接种。
其实在板上长的时候因为菌落里面有那个biofilm, 所以只要最底下一层是有抗性的携
带质粒的菌，顶上肯定也就是。而且零星长起来的突变抗性菌没有办法跑过去占他们的
地盘，所以菌种比较单纯。但是在摇的菌液里情况就完全不一样了，突变体很快就能取
代携带质粒的菌体，因为携带质粒其实对于细菌而言就和我们被感染了寄生虫是类似的
，都是个负担。
有一个小窍门就是把一个单克隆挑出来在板上满满的涂一大圈，然后长起来后把整层都
刮下来放到培养液里去再摇个８小时就可以做中提了。 |
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n********e
发帖数: 1630 | 15 我用50ml的培养液，不知道是中提还是大提。我直接从板上挑单克隆进入50ml，
overnight，产量500-1000ug |
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b**y
发帖数: 86 | 16 个人感觉我们对于生物起源的了解实在是太少太少，离我们能够确定的说“生命就是这
样开始的”程度还差的太远太远。作者所说的最多只是一个假说，而作者的很多所谓的
论据都是断章取义，有些故弄玄虚，其实并没有多少说服力：
比如说所谓的“斯皮格曼的怪物”（Spiegelman Monster），没有说清楚实验是在加了
RNA replicase的培养液中；这样经过足够代选择加入的RNA当然最后只剩下和RNA
replicase binding的部分，没什么稀奇；可这和所谓的”原始汤”环境有可比性吗？
氨基酸和其他生命的小分子（核酸、脂类）在地球早期严酷环境中产生（无论在空气、
海洋火山还是火山湖泊中）或者从陨石中带来，这是生命产生的前提，而米勒实验是证
明了这种自然产生的一种可能性。它的意义被作者一句话否定掉了？
又比如说到“黑烟囱”生命起源假说，说到最后是：“只需要用着白给的能量
发明膜就行了。”似乎已经无比简单了。可大哥，你是说要发明含ATPase的lipid膜吗
？大哥，ATpase是个如此复杂的蛋白，怎么说有就有了？而且就算有了，怎么才能遗传
啊？ 是得进化出一个RNA 的ATPase吧，... 阅读全帖 |
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J******9
发帖数: 736 | 17 新课题，需要培养小鼠侧脑室（LV）取材的神经干细胞(NSC，)，进行“悬浮培养神经
球（neurosphere）。我也是第一次接触这个技术，很多方面不懂，虽然看了不少参考
资料。
我的大致实验步骤：LV切割下来后，消化细胞，细胞板计数后，按照5000个细胞/孔，
每孔0.5ml 液体量，接种到non-treated 24-wells培养板，进行悬浮生长。
培养基为：DMEM/F12, bFGF,EGF, B27, N2。（每2-3天添加新鲜培养液0.5ml。）
今天是接种第9天，显微镜下观察，大量悬浮细胞，成片状，中间夹着着一些小的“神
经球”。
问题：
1， 组织消化后接种，那些非神经干细胞来源的细胞，12-24小时后就不能存活了，
成为死细胞。这些死细胞如何可以从培养孔中清除？因为我每隔2天，仅仅添加等量的
新鲜培养基，那些死细胞仍然残留在培养孔里面。今天是第9天，虽然能看到神经球，
但是神经球周围大量成片的死细胞，很影响照相。
2， 我这种情况，是否需要“半量换液”来清除死细胞？大家是如何进行半量换液
的？看了不少文献，还是有点模糊。
3， 我的取材是1月龄、3... 阅读全帖 |
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J******9
发帖数: 736 | 18 另外，在falsk里面养悬浮神经球，半量换液，如何操作？
吸管吸取瓶子里面陈旧培养液的时候，不是有可能将神经球也顺带吸取出来了吗？ |
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o****u
发帖数: 214 | 19 我倒不这么看。微生物学科是很老的学科，但这个金矿还远远谈不上被发掘了多少。
微生物的最重要的发展方向之一还是工业微生物的开发。这当然是个非常复杂的工程，
不过目前来看，已经有一些很好的成果了。比如现在用于碱性蛋白酶生产的菌株，可以
达到每毫升百万U级别的表达量。这样的菌株从合成元件，到分泌系统，以及后修饰，
甚至菌种的外形全都改的面目全非了。最终培养液中分泌的蛋白酶能达到200g/L这样近
乎匪夷所思的程度。这几年，由于新的测序技术和转基因技术的引入，做微生物研究的
速度是大大加快了。二代生物燃料的菌株马上就要商业化了，传统化工公司比如BASF也
开始工业化一些微生物途径的大宗化工原料生产。
借着系统生物学和合成生物学的春风，未来十年微生物学应该还有一个大的发展。像商
业菌株开发这样的工程化研究，个人单打独斗是基本不行的，必须要上大团队才行。但
是小型实验室的研究者在方法学上应该还有很多的机会做出贡献。比如代谢计算模型的
建立，计算机辅助合成元件的设计以及新的实验方法的引入等等。
我个人认为与其去抱怨学科的陈旧，亦步亦趋的照着十年前的文献死做，不如多想想怎
么能为这个学科的发展做出新的... 阅读全帖 |
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o****u
发帖数: 214 | 20 呵呵，你说的基本上是十年前的技术指标了。现在还做二三十克表达的话，肯定是只有
赔钱的。百万u/ml级别的产率，不是正好一百万，而是数百万。
对应的百克级表达，我认为应该算是一个跨时代的东西。从百毫克到克级，甚至克极到
十克极的，都可以用传统的优化来做到。到百克级就完全不一样了。培养液中的能量物
质绝大部分都要用到生产目标蛋白，而不是维持细胞自身生长。而且细胞需要存活在２
０％浓度的蛋白质溶液中。具体是怎么做到的，我只知道一些表浅的技术手段。整体的
系统设计，那是商业机密，除了几个大BOSS,就算是子系统的项目负责人都不可能知道
的。
至于你说的工业界和学术界差异的问题，我很赞同。其实很多时候，还不是专利的问题
。而是工业界很多东西，根本就不发表。比如，你现在把诺维信的专利找齐，你也复制
不出来他们的生产线的。
菌株 |
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a****d
发帖数: 1919 | 21 你用的是primary NSC 吗？ 培养液里面有没有bFGF和EGF？
如果是的话，撤掉bFGF和EGF，不加血清和RA，加BDNF,GDNF。这样Neuron的比例应该会
提高。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 22 首先，你有愿意养你的老公，那你还担心什么？
第二，Ohio 州的几个比较好的学校/研究所，Ohio State University，Case Western
Reserve，Cleveland Clinic。 不幸的是，据说变态老板都比较多。但是，美国的压力
也没有你那个美国博后说的那么可怕，周末还是有的，只不过一般人如果周末没有事的
话，都会去个小半天，换换细胞培养液或者喂喂老鼠。而且美国博士后的压力主要还是
来源于职业前途，而你因为有老公，这方面应该没有那么大的压力。
至于工资水平，一般就是按照NIH guideline, 第一年四万出头。不过，现在位置不多
的样子，你可能没有太多挑剔余地。
点。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 23 先把treatment和培养液混合好了，再分到每个well,应该没有问题。药物是看浓度，
medium体积在每个well里10%的误差问题不大。如果你的试验是和细胞数量有关，在把
细胞放进每个well里时，最好不用repeating pipet。 |
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w******y
发帖数: 4871 | 24 俺们不做动物,用的是人的外周血.
培养液里加不同浓度的东西,看看Th1, Th2 cytokines level or ratio有没有改变. |
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g********i
发帖数: 207 | 25 还没看到原文。不过我以前实验室一个学生曾经用不同酸碱度的培养液养imr90.基本上
ph小于6.8的最多三天就死了。他这个结果怎么证明不是癌细胞呢？ |
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s*********y
发帖数: 292 | 26 我拿一个化合物处理细胞，比如讲加在培养液里3h后，有没有什么办法可以测定这个化
合物在细胞内的浓度？
我现在可以用LCMS检测这个化合物 |
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g****s
发帖数: 1755 | 27 之前做过药物透膜实验时用的HPLC；
大概思路：
1 先做一组标准液；
2 然后计算（估算）一下你的平皿里大概多少个Million的细胞；
3 PBS洗掉培养液后收集细胞，裂解并用有机溶剂萃取，定容到10ml 或者1ml；
4 跑HPLC测含量，逆推回总Mol量，然后计算得到每百万细胞里含有的浓度。 |
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h*******l
发帖数: 16 | 28 先要测一种药物对细胞基因表达的作用，要把药物加到细胞培养液中去。这是一种
非水溶性药物，可以溶解在DMSO里面，但是溶解度也不高。需要用DMSO配置固定浓度的
STOCK SOLUTION(10^-5 M).又是加热又时sonicate，好不容易总算是把药物溶进去了。
但是不确定是不是达到目标浓度了。请问有什么方法可以确定溶液的浓度呢？谢谢！ |
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H****s
发帖数: 301 | 29 往细菌里转了一个基因文库，发现了一个表型改变。似乎这个表型变化是不可逆的，挠
头中。我更感兴趣的是细菌的这个新表型。请问有没有什么办法去掉细菌里转进去的质
粒？这个质粒是基于pUC Ori的，是个高拷贝质粒。如果我在没有抗性的培养液中连续
传代，会不会彻底除去？谢谢。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 30 airborne这个词容易让人误会，其实大部分细菌和病毒都不能单纯的“airborne”，都
是要附在微尘或者微型液滴上。
要把culture flask 里的培养液搞成airborne droplet，除非你拿着瓶子狠狠地甩来甩
去弄出一堆泡沫，然后把瓶口打开大口大口的对着瓶子呼吸。
这种事情除非发神经或者要自尽，否则没有人会做吧。
而滤膜的一个功效就是只允许空气经过而会拦下几乎所有的droplet。所以你担心的这
个事情根本没有任何可能发生。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 作的对。不要把有限的生命投入无限的和酵母的战斗。
不过，你确定肯定是酵母感染么？对于没有经验的人，有可能会把Mycoplasma感染造成
细胞死亡的碎片错看成酵母。
最简单的办法是把你们培养过细胞的培养液直接涂在YPD 板上，看看能长出什么样的东
西来。细菌，霉菌，酵母，都能在YPD 板上长，Mycoplasma不能。
如果是Mycoplasma，或者酵母，或者霉菌，这些东西绝对会没完没了，阴魂不
散。最简单的办法就是把感染了的细胞全部扔了买新的。
如果是霉菌或者酵母，你们的培养箱必须拆了把内壁全部高温消毒两次（一定要两次，
因为包子一次是蒸不熟的）。箱内循环风扇啥的全部扔了换新的。
如果嫌麻烦而且老板有钱的话，直接把培养箱扔了买个新的。
液氮罐最好把液氮都化掉，然后清洗晾干后再使用。因为酵母，霉菌，和Mycoplasma是
可以通过液氮从一个管传到另外一个管的。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 32 不需要。
关键是培养液要装满。而且要用那种不会漏的盖子。（不要用filter cap) |
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s******s
发帖数: 13035 | 33 当然都会有，量多少而已。
你加点毒药把细胞弄死，那么DNA全跑出来了。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 34 也不一定， 因为很多细胞能分泌核酸碎片的。
你这个得做其他实验（比方说细胞活性实验）之后才能下结论。 |
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k***g
发帖数: 4904 | 35 如果有对照试验，没加药的没有遗传物质，加了药的有遗传物质，是不是可以排除你您
说的这种情况？ |
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j******i
发帖数: 939 | 36 等克隆长大一点，用带大概20ul培养液的枪头搓几下，然后吸上来不就行了吗？ |
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s*****g
发帖数: 7857 | 37 1。在dish里铺很少细胞，长起来后在显微镜下面挑单克隆到96well里养
这得克隆长多大啊，还得肉眼厉害。。。。
2。稀释分散到96孔板
好主意，悬浮细胞我就这么做来着
3。FACS SORT 到96孔板
这得带标记啊。有时GFP啥的未必是好东东。
4。等克隆长大一点，用带大概20ul培养液的枪头搓几下，然后吸上来不就行了吗？
问题是一个平皿里有很多单克隆。如果这样就只能采一个克隆。否则细胞扩散，不就把其
他克隆的细胞搞混了么？
5。C1059 SIGMA sterile cloning cylinders with grease
这是我以前传统用的手法。
现显微镜小标记，然后用cylinders with grease（trypsin)选出来，再放在小dish里
扩增。。。
谢谢各位亲们的宝贵建议！！！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 对于绝大部分情况都是可以的了。
唯一要注意的一点是要把细胞培养液完全去除。
X |
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w*****r
发帖数: 2061 | 39 在显微镜下看看已经浑浊的dish，看长的什么东西，其他没有浑浊的dish可能已经污染
了，浑浊是迟早问题。
细胞不珍贵的话，全扔了，培养液全换（有过滤吗？），清理培养箱(有的自带灭菌功
能)，下次小心操作，先试几盘。 |
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o**4
发帖数: 35028 | 40 我有个ES细胞系，里面有FLP/FRT系统，有能直接处理细胞的Flippase吗？
是不是都得用病毒之类的flippase？这样会整合到基因组吧？
非常感谢， |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 这个很麻烦，真菌污染很难去除的。
当然，如果你要确认的话，可以把培养液吸出来然后涂到琼脂板上去，看看能不能长出
真菌群落来。
between |
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m*********D
发帖数: 1727 | 42 谢impeccable和sgu2000。生活没有回头路，只能向前看。
昨天有去钓了一把。带系里的一个Ap去的。不错，两个人都有十几斤的收获。回家作个
鱼汤，喝上一瓶啤酒。这不今天有早起进实验室给细胞换培养液么。加完班回家陪太太
shopping，这个礼拜吃的还每打货呢。
周末愉快！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 44
你的朋友说的是从病人身上直接分离出来的原代癌细胞(primary cancer cell)。
的确是很难培养的，不同来源的癌细胞需要用不同的特殊培养液和环境，而且很多会死
掉。因为不同的癌细胞也有不同的恶性之分，有的癌细胞需要某些特定的环境才能生长
，其实生物学里面针对这个还有一个所谓的肿瘤环境的研究方向。
至于有些同学们给你回复说的Hela cell, 那些是在培养的癌症原代细胞里面被筛选出
来的一些生长特别强的癌细胞，可以在大部分培养环境下生长。
至于你说的那些干细胞啊 血脑屏障细胞 肝细胞之类，其实大部分都是那些经过体外训
化的有了一定变化的细胞，并不是原始的体细胞。如果是在人身上直接分离出来的原代
体细胞（(primary somatic cell)，培养起来也是非常麻烦的，也是需要非常特殊的培
养液和环境的。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 45 （CRISPR的背景资料请参阅Feng Zhang的“Genome engineering using the CRISPR-
Cas9 system”，Nature Protocols 8, 2281–2308 (2013)）
背景
我们是作一个与激素相关的肿瘤的。这个肿瘤的治疗方法已经相当完善，就是让身体里
不能生产激素或用一个小分子化合物抢占激素受体上激素的结合部位。但多年治疗后，
会有相当比例的病人产生抗药性。这个抗药性机理相当复杂。我们实验室一直致力于筛
选和现有药物不同的机理的小分子化合物，包括受体和DNA的结合或其他与受体相关的
pathway的inhibitors。前几年成功地筛选出了几个不同机理的化合物，个别在细胞水
平达到了nM的级别，动物测试也在10 mg/kg的水平。
最近在这个领域对抗药性肿瘤的研究发现，部分病人的抗药性是因为受体激素结合部位
发生了突变。一个或几个氨基酸的突变就能导致肿瘤细胞的生长不能被现有药物抑制。
所以，我们很想知道我们筛选出来的化合物对这些突变受体是不是也起作用。理论上来
说，我们的化合物不和激素竞争，突变不会影响我们化合物的效果。但只... 阅读全帖 |
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j******i
发帖数: 939 | 46 为什么韩春雨一直咬着细胞污染不放呢 难道他还不知道现在测支原体污染只要送一点
培养液去公司两天就有结果了吗 之前澎拜新闻有一篇报道里边的案例已经排除细胞污
染但结果还是没有基因组切割 |
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发帖数: 1 | 47 新发现丨细胞常温运输的高效简易方法！
2017-06-03 邓文生 等 细胞
2017年4月18日，武汉科技大学生命科学院邓文生教授在美国公共科学图书馆的期刊上
发表一篇题为“The analysis of viability for mammalian cells treated at
different temperatures and its application in cell shipment”的研究论文。主
要验证了在室温下运输细胞的简易方法的可行性。
目前，传统的细胞运输方法包括冷冻储存运输和充液法。细胞存活率较高，但是都只
能短距离运输，花费高。近几年，也还有一些关于细胞运输方法改进的报道，例如有用
agarose胶或matrigel基质与细胞混匀后，再在室温运输。这种种方法都非常繁琐复杂
，影响因素较多。
邓教授在英国做实验时，一个小的失误，意外发现室温下放置的细胞在第二天仍能保持
较高的活性。就想是否能够直接在室温的条件下运输细胞，从而简化细胞的运输方法。
为了验证这个方案的可行性，该实验室采用其常用的细胞系M2进行一系列验证。首先确
定细胞密度为1*105 ... 阅读全帖 |
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m****a
发帖数: 270 | 48 文章说的是细胞培养液。曾经常温把细胞装在装满培养基的FLASK里面给人快递过，两
天没啥问题。
问题在于FACS之前细胞一般重悬在PBS里面，这个时候可能4度更好。 |
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发帖数: 1 | 49 求推荐一款方便耐用的PH计，平时主要是配置特殊的一些动物细胞培养液。 |
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w**********a
发帖数: 29 | 50 还好吧？如果说化学人抑郁是因为这个，那生物人抑郁是因为细胞培养液？ |
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