h******t
发帖数: 56 | 1 又来问问题了。VSV可以aerosol传播，那VSVG包裹的lentivirus呢？传播途径和包裹蛋
白有关系吗？
还有就是HIV在空气中很不稳定，但是VSVG包裹的lentivirus会不会延长virus在空气中
的存活时间呢？ |
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h******t
发帖数: 56 | 2 我也觉得这个问题有点傻。但是翻看了很多文献，也没有人具体的比较过VSVG包裹的病
毒和正常的HIV。而且好像决定HIV只能这三种途径传播的主要原因是HIV virus只存在
于血液，体液中，并且存在浓度很低。我就不确定对于实验室这种在cell culture里面
培养而且浓度较高的VSVG包裹病毒，是不是需要加以更多的小心。 |
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i*****i
发帖数: 154 | 3 二代和三代的差别，在packaging system上，由二代的Gag/pol/Rev + VSVG，变成了
Gag/pol+Rev+VSVG，两质粒变成三质粒。病毒的编码区的进一步分割，分离，可以降低
重组野生病毒（有自主复制和感染能力）的可能性。
比较典型的二代是pspax2+pMD2.G 以及pcmv dvpr 8.2+pCMV VSVG。
而比较典型的三代是pMDLg/pRRE+pRSV-Rev+pMD2.G, 以及Invitrogen的包装系统，都是
三代。
其实clontech的包装系统应该是第四代了，虽然这个系统采用了旧的驱动系统，但是对
整个病毒蛋白的编码区做了进一步的split，并引入了tet调控，所以，应该是更安全一
些。但是共转染7个质粒的效率，显然不如三个。所以，第二代系统仍然是titer最高的
最有效的系统。 |
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m**1
发帖数: 2 | 4 我想用Lentivirus介导针对某一基因ShRNA感染U2OS细胞以Knockdown该基因的表达，结
果是反复几次均未成功----感染U2OS细胞后用Puromycin筛选，细胞全部死亡。这说明
可能1）Lentivirus没有包装成功2）U2OS对Lentivirus敏感3）----？
我有该种Lentiviral表达质粒直接用Fugene
6转染U2OS细胞，然后用puromycin
筛选，有大部分细胞survival,说明Lentiviral表达质粒没有问题。
我包装Lentivirus的过程是：
Co-transfect下列质粒至 293T 细胞（用Fugene
6），48小时后，将上清液过滤，直接加到U2OS细胞上，48小时后加入Puromycin进行筛
选。
Lentiviral质粒 5ug
Gap 2ug
Rev 2ug
VSVG 2ug DNA总量 11ug, Fugene reagent 33ul.
第二次加大了DNA量，但还是不成功。
Lentiviral 质粒 10ug
Gap 3ug
Rev 3ug
VsVG 3ug DNA 总量19ug,Fugene 57 |
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D***a
发帖数: 516 | 5 用293T细胞，转lentivirus病毒载体和gagpal+vsvg,产生的病毒是不是有一部分又感染
回到293T了？那这个会增加病毒产率（比如说感染回去，vector又可以被复制，产生新
的病毒）还是降低病毒产率（病毒被消耗掉了）？
我的一个shRNA病毒产量总是很低（一个是共转染之后293T荧光少（载体含GFP），另一
个是病毒infect target cell后筛选，得到的克隆少得多），跟control和另外一个
gene family isoform相比。我做了不加gagpal和vsvg,把载体单独转到293T里面，从
GFP荧光看plasmid质量没问题，跟control是一样的。查到有文章提到这个蛋白可以帮
助病毒entry，是不是就是病毒低的原因呢？
谢谢大家。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 6 如果用的是VSVG，那么这种形态是非常典型的，多个细胞聚集成团，形态变圆，
由于VSVG的细胞毒性造成的。
不过看来你的包转效率不够高啊，否则的话感染之后一般满屏都是阳性细胞根本
不用去怀疑是不是没有被过滤掉的273T |
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j****x
发帖数: 1704 | 7 有对照吗？
尝试降低vsvg包膜蛋白质粒在转染时的配比，vsvg的毒性对很多细胞比较强。另外就是
尽量提高包装效率，用尽量少的病毒上清感染
primary |
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e*******c
发帖数: 1479 | 8 最近用了invitrogene的pLKO-Tet-On诱导系统做shRNA， 用VsVg和Delta8.9做包装，
但就是不能产生病毒，或病毒低度基本测不到， 那位大虾用过此系统， 难道不能用
Vsvg包装体系而必须买他们自己的viralpower系统？
谢谢 |
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s********s
发帖数: 84 | 9 测基本上是，是把得到的virus稀释后 infect细胞 然后用抗生素blasticidin 选出来
有抗性的以后 染色 数有多少colony。
载体重组了。。如果是这个原因 有啥办法呢。。只能换载体么。。
to neverthink 更多的细节啊
是用PENTR3C （里面有表达目标蛋白的gene）
然后和 plenti6/V5-DEST 做LR recombination
得到colony做酶切 看看位点之类的对不对
最后得到plasmid （用来做transfection之类的能得到蛋白表达）
用这个plasmind然后和pLP1, pLP2, pLP/VSVG之类的一起transfection 293T 细胞
得到virus
然后infection 然后检测蛋白没有。。
曾经用同样的办法做了几批virus，曾经有一批是能检测出来的。
但是后来我再做就不行了= =
反反复复几次以后 老板就让我重做一遍vector 就是从PENTR3C和自己目标蛋白gene 酶
切，ligation那步开始重做。也不说为啥要这样。一摸一样的方法重做一遍会有啥改变
么。。
PENTR3C这个原始的载 |
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p*****y
发帖数: 44 | 10 Transfect HEK cell to produce retro virus. 260:280=1.9 Qiagen大提的质粒
效果不怎么好，尤其试用VSVG做envelope protein, 请问有没有别的方法提高DNA纯度？
文献说CSCL最好，但是太麻烦。试过醋酸钠重新沉淀，酚，氯仿抽提一下，纯度没见到
变化，再转染，不产生病毒了！
求其他纯化方法！ |
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j********r
发帖数: 156 | 11 An update - 10 days after seeding infected cell on feeder MEF (or 13 days
after initial infection), I found one ES-like clone. If it is IPS, the
efficiency is extremely low (one clone from 50000 cells seeded).
The virus might be the reason for that, but I am not sure about the quality
or titer of the virus supernatant I made from 293T cells (the ratio of OSKM
to CMV delta 8.91 to pMD2-VSVG is 4:3:1). Also this time I used frozen sup.
I will try fresh one next time.
The purpose of this experiment |
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D***y
发帖数: 693 | 12 用的是vsvg。不知道为什么包转效率很低。转293T后看了一下gfp,很多细胞是positive
的。 |
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T********e
发帖数: 223 | 13 暂时找不到具体的vector图谱。
我们用三个helper vector：p-gag／pol； p-vsvg; prsv－rev。不知道有没有帮助 |
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d**********2
发帖数: 103 | 14 小弟有点问题想向各位大牛请教：
小弟在用利用LENTIVIRUS在细胞里面过表达一个蛋白。
用得载体是LV-CMV-GFP, 包装载体是CMV-VSVG 和pHR`-CMV-R8.20-Vpr.
现在的问题在于，可以成功拿到表达GFP的病毒，但是拿不到能表达我的蛋白（GFP
fusion）的病毒（被感染的细胞没有GFP荧光信号）。
我在制造病毒的时候，我知道我的蛋白表达得很好（有特定得PATTERN， 荧光信号也很
强），所以应该是CONSTRUCT应该没有问题。问题可能在于我得蛋白会引起细胞凋亡而
影响病毒得产生和包装，但是我有相应的 non-toxic 的点突变，但是我也无法拿到表
达这个点突变基因的病毒。。。所以比较迷茫，想问问大牛们有啥好的解决方法。。。
。（基因不大，才700多BP。。。）
谢谢！！ |
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b**********8
发帖数: 349 | 15 如题，lab里面之前一直用的磷酸钙沉淀法，个人觉得特别繁琐。我比较懒，想换用
lipo2000或者genejuice来转，我们一直用的是PLKO.1shRNA+PLP1+PLP2+PLP/VSVG系统
，在10cm dish里面操作。有谁使用这套系统制备慢病毒，并且刚好也用lipo2000或者
genejuice转染试剂的，甩一个你们的成熟的protocol给我吧，特别是各质粒的用量，
换液时间，收集上清的时间等参数，越详细越好啦。不想为了摸索条件再浪费1个礼拜
的时间了。
谢谢 |
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s******s
发帖数: 13035 | 16 我们在60mm dish里面做的
4ml medium + 1ml lipo的mix
里面大概20ul lipo, 2ug pMDL， 1ug VSVG, 1.5ug Rev, your DNA 3ug.
，不洗的 |
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a*******a
发帖数: 4233 | 17 不需要洗， 收病毒上清以后pall 0.45um滤器过滤一下。
我一般用fugene hd， 更省事
10cm dish 20ug质粒，50ul fugene。
我是用plko+r8.91+vsvg的。
ps 我个人觉得钙转最省事
5min转完， 10-24小时之内看心情换液就可以了。。。。
脂质体的话还要等半个小时穿插传其他细胞，麻烦。。
，不洗的 |
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j******i
发帖数: 939 | 18 我觉得你可以做以下尝试
1. 直接用transfer vector(含你目的基因的那个plasmid, 不用vsvg，REV, gagpol)
transfect你的cell 可以看到蛋白条带吗？如果没有，说明你的目的基因可能出错了，
是不是in frame啊，有没有kozac sequence啊。。。如果有蛋白条带，那么
2. 测p24, 看看到底没有virus啊。如果有virus，那么
3. Infection效率如何啊，有没有足够多的virus啊。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 手头上有一堆retroviral vector (pBabe and pQC, PsR, etc.) 一直都是
用retroviral packaging system (GAG/PoL + VsvG)
最近想用lentiviral system,以前从来没有用过，所以想问一个白痴问题，
就是能不能直接用以前的vector装到lentiviral packaging system里面?
随便看了看lentiviral 的说明书，貌似好像没有问题？ |
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r***e
发帖数: 2539 | 20 应该不能aerosol传播，而且酒精一喷就死。
不然的话，怎么能BSL2呢？ |
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d*p
发帖数: 534 | 21 If you use VSVG, answer is Yes, but won't decrease titer.
If you use ECO, then Eco packed virus won't infect 293T. |
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c****1
发帖数: 1095 | 22 是VSVG。
为了得到最大的产量，是不是最好每隔12或者24小时收一次病毒？转染后，最多养到72
小时？ |
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b**********8
发帖数: 349 | 23 这个问题快困扰我一年了，今天特意翻墙过来求助各位大大，
事情是这样的，之前在博士的实验室一直用pLKO.1-puro shRNA干扰基因表达，用的
invitrogen的包装质粒（PLP1，PLP2和VSVG），在10cm的dish里面用HEK293FT转染，转
染用的是磷酸钙沉淀法，病毒上清用SBI的 precipitation solution（5x）浓缩，一直
都work well，偶尔偷懒奢侈一把用lipo2000转染，效率也是没得说。自去年博士毕业
回国后来到现在这个小实验室，当时雄心勃勃自信满满，打算自己包装慢病毒，用的还
是跟之前一样的质粒，细胞，只不过换到了T75的flask里面，用lipo2000转染（磷酸钙
转染法配buffer太烦，实验室pH计不准，老板对经费管的也很松，哈哈），之后用同样
的方法收病毒上清，浓缩。感染细胞后加puromycin筛选，染毒的细胞都能活下来，而
对照细胞48小时候就死光。可是收集细胞蛋白做WB却一点都看不到knockdown，前前后
后重复好几回了，都是一样的结果，现在无奈把这一块交给公司做了，但是自己还是不
死心，今天写出来问问大家... 阅读全帖 |
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b**********8
发帖数: 349 | 24 如题，想验证下手上的这几个质粒，懒得自己设计了，请教各位谁知道这三个质粒的测
序引物序列，最好能把三个都测到的，谢谢！ |
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s******y
发帖数: 28562 | 26 当然需要。
VSVg是病毒的包装外壳蛋白。没有了这个病毒就包装不成功了。 |
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V******t
发帖数: 444 | 27 只用两个包装的呢？
pMD2.G psPAX2
或者
pCMV-dR8.2 dvpr＋pCMV VSVG |
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