c******y
发帖数: 148 | 1 个人的配方。
13% tris tricine分离胶 stock 4摄氏度不超过4周
40%丙烯酰胺 156ml
3Mtris HCl pH 8.45 160ml
10% SDS 15ml
H2O 113ml
甘油 36ml
每100ml加10%APS 500ul， TEMED 20ul
stacking gel， 现配
40%丙烯酰胺 1ml
3Mtris HCl pH 8.45 3.33ml
10% SDS 0.31ml
H2O 5.35ml
每10ml加10%APS 100ul， TEMED 10ul
15*Anode buffer
3M tris Hcl pH 8.9
5*Kathode buffer pH 8.25 用时稀释1*，加0.1% SDS
0.5M Tris
0.5M Tricine
分离胶可以考虑16%，也可以做成10-16%梯度胶，不过分子量小的话，不梯度也行 |
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F******y
发帖数: 1988 | 2 一般情况下蛋白电泳都用Tris-Glycine buffer system
低分子量蛋白（10kD一下）一般推荐用Tris-Tricine buffer system
有没有用过这种方法的筒子们上来说一下，能有详细的protocol，kit catalogue等的
最好，没有的话讲讲实验tips也好。
包子奉上，小生在此有礼了。 |
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F******y
发帖数: 1988 | 4 你都是直接买现成的胶阿，实验室有钱就是好
本人是第一次用tris-tricine buffer system
这次就定了一个Acrylamide-Bis Solution和一个低分子量的protein marker
其他的都准备自己配了，不知道结果会怎样，期待中。。。 |
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F******y
发帖数: 1988 | 5 刚试了一次Tris-Tricine SDS-PAGE先跑了一下protein marker
效果不好，想直接贴图上来，继续向大家征求建议。 |
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S******e
发帖数: 393 | 6 用tris-glycine也可以吧，准备用10-20%的gel, 0.2um的nitrocellulose membrane,
湿转100V, 1 hour可以吗？
从没用过tris-tricine，有什么好处？
THX! |
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c*********d
发帖数: 9770 | 7 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 8 不好意思，乍一看给看成了tricine,心想疯人要做胶干嘛？ LOL |
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T**********t
发帖数: 1604 | 9 http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(82)90113-0
Electrophoresis buffers for polyacrylamide gels at various pH
Tracy McLellan
Analytical Biochemistry
Volume 126, Issue 1, October 1982, Pages 94-99
http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(87)90587-2
Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the
separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa
Hermann Schägger and Gebhard von Jagow
Analytical Biochemistry
Volume 166, Issue 2, 1 November 1987, Pages 368-379
http://www |
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T**********t
发帖数: 1604 | 10 那就先把甘氨酸溶好了再加SDS？
我没配过啊，瞎说的。
我用的都是Tris-Tricine不连续buffer系统。 |
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F******y
发帖数: 1988 | 11 Anal Biochem. 1987 Nov 1;166(2):368-79.
Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the
separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.
Schägger H, von Jagow G.
Institut für Physikalische Biochemie der Universität München, Federal
Republic of Germany. |
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F******y
发帖数: 1988 | 14 还想请教如下的问题
1。制胶的时间大概多久（指从把胶注入胶板到能够使用的时间）
2，请问您用的marker protein是什么（能告诉我catalogue number最好了）
3，Running 和Transferring的条件分别是什么（电流/Gel，电压/Gel,多长时间？)
4，转膜时用的那种膜（PVDF？） |
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F******y
发帖数: 1988 | 15 i see
thank you so much |
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F******y
发帖数: 1988 | 16 sinister同学说什么了阿，为什么删贴阿
欢迎更多有经验的同学进来讨论，都有包子。 |
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f********n
发帖数: 6465 | 17 为什么姐姐博士期间没有做过western blot啊? |
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T**********t
发帖数: 1604 | 18 我一般是用5%的浓缩胶和15%的分离胶，不加甘油，别的基本一样。倒是从来没有试过
分离胶配储液放好几个星期的，都是现配现用。 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 19 你如果自己没有制胶的经验，不如买预制胶好了，效果比自己配的好太多了，还省事。
我自己制胶一般花40分钟左右，分离胶和浓缩胶一般10分钟就凝了，15分钟左右基本上
肯定凝得很好了，再加上前后准备的时间。
invitrogen的protein marker从3.5K到260K，应该很够用。cat #是LC5800或者LC5801
。其实protein marker都差不多，promega和fisher的我也用得挺好，就是没有那么小
的分子量，但做多了就知道自己的目标蛋白该跑在什么相对位置，毛估估也对付得过去。
一般我跑bio-rad的mini胶，用5%浓缩15%分离的话，常温跑160V恒压40分钟左右。如果
是预制胶，按照预制胶的说明书来就好了。
我不怎么做western blot，所以transfer的条件就不知道了。 |
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F******y
发帖数: 1988 | 20 做过了
一般用的是Tris-glycine buffer system |
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F******y
发帖数: 1988 | 21 非常有用的tips
受教了
LC5801
去。 |
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c******y
发帖数: 148 | 24
1, 1-2hrs
2, fermentas prestained PAGE ruler google
3, Running, big gel constant 70V overnight, transferring as Tris glycine gel
4, PVDF or NC |
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c******y
发帖数: 148 | 25
呵呵 懒了 一次就用掉200ml，消耗很快，倒是stacking gel从来不敢这样，很快就坏
掉了
不过，现在更懒了，二维不用stacking gel，直接跑 |
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T**********t
发帖数: 1604 | 26 10%的胶跑11kD的蛋白不太合适吧。用Bis-Tris或者Tris-Glycine的梯度胶应该也能分
得很好的。 |
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z****g
发帖数: 3340 | 27 额得神。Tricine-SDS page is perfect for such separation. good luck! |
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I***a
发帖数: 13467 | 28 参考这个文章 Tricine–SDS-PAGE |
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x*****o
发帖数: 441 | 29 用tricine sds page好像对分子量小的蛋白效果比较好.
low
load |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 tris-glycine可以。
但是最好不要用高电压转。不然蛋白很容易直接穿过膜导致可检测的量非常低。
建议用30伏，4度，转过夜。 |
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S******e
发帖数: 393 | 32 多谢！下次就用低压转。已经跑了一次胶，高电压转的膜，检测的信号的确非常弱。
除了低压外，如果用0.1um的膜会不会效果好很多？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 33 0.1um的PDVF膜会更好。
另外，可以把甲醇浓度调高一些。可以调到30~40%。最低也得用20%。 甲醇的功能是：
1。洗脱蛋白上多余的SDS，让蛋白跑得不要太快； 2。让蛋白充分变性，能和膜结合得
更紧。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 36
请教一下30V， 4C，overnight和110V， 1.5h的transfer有什么区别？我从来没做过前
者，觉得时间太长了，western做完要好几天。不知道有什么有点没有？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 37 30V， 4C，overnight对于无论是大蛋白还是小蛋白都比110V 跑几个小时出来的条带明
显的强很多。
对于中等大小的蛋白则差别不是特别大。
时间会长不假，就看你们更注重什么了。我们经常要做一些含量很低的蛋白，我的一个
博士后用他以前实验室的习惯用110V跑，得到的带非常模糊。我让他改成30V， 4C，
overnight，效果立马不一样。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 Bio-rad的不错。不过我们只用过他们的，没有和别人的比较过。
另外，PVDF膜用起来还是相当麻烦的，需要事先用甲醇浸泡。转膜的时候甲醇不能太低
，而且背景还容易偏高。所以没啥特殊原因不推荐。 |
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t****t
发帖数: 86 | 39 我转小蛋白，看你上面建议0.1um PVDF膜。
另外bio-rad没有0.1um的膜啊。只看到whatman有
【 在 tyzhet (开吉普的金田一) 的大作中提到: 】
: 有不有推荐的 0.1um PVDF膜？ |
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发帖数: 1 | 41 关于电泳条带的拖尾问题
方先生：
您好！
我是您的超级粉丝，从“基因皇后”事件就开始关注新语丝，一直到现在，
只要打开浏览器，肯定要到新语丝上看一看。
看了7月20号关于韩春雨的文章，不谈其它，我只就电泳条带的拖尾现象谈
一下我的认识。
一般情况下，电泳条带拖尾状况正如方先生所说，边缘拖后，中间超前。我
原先也是一直是这样认为的，但是正是这样的认识，差点冤枉了一个研究生。有
一年研究生预答辩时，我看到同组老师的一个研究生ppt中一张蛋白电泳图非常
特别，蛋白条带中间拖后，边缘超前。我就问学生为什么会这样？这个学生说他
也不知道为什么，跑出来的结果就是这样的。maker也是这样。我非常怀疑，但
是保险起见，我没有再争论下去，而是会后自己查了一下，终于发现了原因。他
的蛋白电泳分析的是超低分子量蛋白，用的是Tricine-SDS-PAGE，在这种条件下，
加上电泳仪电压不均衡等其它原因，小分子量蛋白的确会出现边缘超前，中间拖
后的结果。请看网上的一些图片：
http://www.chem17.com/offer_sale/detail/11291438.... 阅读全帖 |
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