l*****i
发帖数: 1163 | 1 请问有人知道T2A序列是在什么时候被切割的么？比如蛋白A－T2A-蛋白B，是翻译到蛋
白A－T2A即启动切割还是要等到全部翻译完毕再启动切割？
多谢多谢！ |
|
d****d
发帖数: 214 | 2 T2A编码的是一个peptide，可以连接两个蛋白质的coding sequence使其转录时为一个
mRNA但在翻译时分开成为两个独立的蛋白。
以你的问题为例子，你可以在T2A上游插入你感兴趣的蛋白质的coding sequence，最终
你的蛋白和puromycin resistant gene (Puromycin N-acetyl-tranferase)所编码的蛋
白会被翻译成两个蛋白。这种同时表达多个基因的策略同IRES策略相比，好处是上下游
蛋白的比例理论上讲是严格的1：1. |
|
J****n
发帖数: 156 | 3 在下做植物的，猜想T2A puro应该是个promoter吧？谢谢解惑。 |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 4 能具体给个文献么？文献太多了
拿如果是直接跳跃的话，那会留下尾巴么（残留的T2A 序列） |
|
l*****i
发帖数: 1163 | 5 你的意思是翻译同时开始么？那么第二个蛋白是以T2A里的序列作为起始密码子么？ |
|
m******5
发帖数: 1383 | 6 想构建ChR2 T2A linker DTR pA这样一个cassette
打算Gblock ChR2 T2A
T2A DTR这样一个组合，然后 Gibson assembly
求可靠的ChR2 DTR T2A linker序列！
谢谢！ |
|
s******s
发帖数: 13035 | 7 多谢了。
我是想做T2A接一个ER resident protein。因为有C端KDEL，所以只能放在3'，
那么T2A cleavage前面就多出来一个P。刚问了一本校的专家，说是没关系，还
给我找了一篇文章里面也是用2A的。我之所以担心，是因为知道如果接氨基酸多
了可能变成transmembrane protein |
|
c**a
发帖数: 67 | 8 好主意！
F2A,E2A,P2A,T2A 的序列由长到短，哪个切割效率比较高？如果效率相当，我倾向于用
T2A,毕竟短一些。 |
|
|
d****d
发帖数: 214 | 10 Why do you want to use P2A? I suggest you use T2A. Before I use 2A strategy
to make a knockin mouse, I tested all four 2A and found that T2A is the best
(and the shortest too). |
|
S*********s
发帖数: 304 | 11 T2A
your-gene-T2A site-puro
在同一个mRNA表达，表达cDNA可以用。
google
The ‘cleavage’ activities of foot-and-mouth disease virus 2A
site-directed mutants and naturally occurring ‘2A-like’
sequences
inducible system
请参考
Wee, S., Wiederschain, D., Maira, S.-M., Loo, A., Miller, C., deBeaumont, R.
, Stegmeier, F., Yao, Y.-M., and Lengauer, C. PTEN-deficient cancers depend
on PIK3CB, Proc Natl Acad Sci U S A. 105: 13057-62, 2008
http://www.addgene.org/21915/
另外还有两载体系统
pCMV6-TetR
TO-shRNA
很多公司都有，google
你现在的stable ... 阅读全帖 |
|
a****d
发帖数: 1919 | 12 准备建一个hESC reporter line, 有几个问题向有经验的大牛们请教。
我准备在目的gene末端插入XFP，那么在HDR之间是否应该这个顺序： last exon(stop
codon removed)-T2A-XFP-UTR？
目前在last exon上面找到了一些sgRNA序列，在stop codon上游大概50-150bp. 请问在
这个距离上double nicking是否可行？
另外选择好了sgRNA后，选择HDR是不是按照double nicking位置向上游选700-1000bp，
然后从last exon(stop codon removed)-T2A-XFP-UTR开始向下游选700-1000bp？没有
其他的特殊要求？
准备donor plasmid时，考虑到很难找到特异的酶切位点去匹配几个不同的片段，这种
几个大片段连接，是不是选择Gibson Assembly Cloning更容易一些？ |
|
|
b****g
发帖数: 4933 | 14 终于在赤峰桥电器城的鑫锋音响见识了ＤＴ－９３１的风采。
器材搭配：
ＣＤ机：ＳＯＮＹ老ＣＤ随身听Ｄ-２５０
某４０００圆价位台式ＣＤ机
耳机放大器：吴刚G&W T2A
参考耳机：森海塞耳ＨＤ-５６５
首先试听的是两张人声专集：ESTHER 希伯莱语专集、蔡琴《金片子》。作为中频至上主
义者，我一直认为器材对人声的重放能力是非常重要的。平时我一直在用的耳机是森海
塞耳ＨＤ-５６５。作为ＳＥＮＮ老一代的顶级耳机，ＨＤ-５６５重放的中频温暖、动
听，虽然有一点染色但是并不过分，所以ＨＤ-５６５的中频一直让是我非常欣赏。但是
就在大眼妹的开唱的那一瞬间，耳边戴着ＤＴ－９３１的我呆住了。耳边的声音松松的
，暖暖的，甜甜的，非常舒服，一点也没有传说中“硬”的现象。声像距离稍远，口型
比例很真实，齿音相比较ＨＤ－５６５只能用“非常干净”来形容。DT-931的透明度和
解析力简直是ＨＤ－５６５无法相媲美的。说实话第二张盘是蔡琴《金片子》我只听了
１首就没有敢再听下去，我害怕自己把持不住当场就去银行取钱收货。。不得不承认，
ＤＴ－９３１的人声真的是太好了，估计没有几个男人能抵挡DT-931播放ESTHE |
|
R**i
发帖数: 7994 | 15 这次时间比较紧，只有3天半，必须有取舍，主要玩的景点
Banff Gondola
Banff upper hot spring
Bow Vally Parkway (1A)
Lake Louise
Lake Moraine
Larch Valley
Agnes Tea House
Emerald Lake in Yoho National
Lake O’Hara
Opabin Plateau Circuit
Lakeshore Trail
Bow Lake
Peyto Lake/Peyto Glacier
Athabasca Glacier
Athabasca Fall
93A：Meeting of the rivers
Mt Edith Cavell
Jasper
Maligne Canyon
Medicine Lake
Maligne Lake
Spirit Island
Miette Hot Spring
行程:
Calgary到达，Edmonton离开，从南往北一路玩过去，可能我租车比较晚了，所以价格
比较昂贵，再加上异地还车，大概花费了四百加元左右，这个价格我今年7月在法国租... 阅读全帖 |
|
R**i
发帖数: 7994 | 16 大大出手真大方，拿人手短，赶紧来发游记了
----------------------------------------------------
这次时间比较紧，只有3天半，必须有取舍，主要玩的景点
Banff Gondola
Banff upper hot spring
Bow Vally Parkway (1A)
Lake Louise
Lake Moraine
Larch Valley
Agnes Tea House
Emerald Lake in Yoho National
Lake O’Hara
Opabin Plateau Circuit
Lakeshore Trail
Bow Lake
Peyto Lake/Peyto Glacier
Athabasca Glacier
Athabasca Fall
93A：Meeting of the rivers
Mt Edith Cavell
Jasper
Maligne Canyon
Medicine Lake
Maligne Lake
Spirit Island
Miette Hot Spring
行程:
Calgary到达，... 阅读全帖 |
|
R**i
发帖数: 7994 | 17 大大出手真大方，拿人手短，赶紧来发游记了
----------------------------------------------------
这次时间比较紧，只有3天半，必须有取舍，主要玩的景点
Banff Gondola
Banff upper hot spring
Bow Vally Parkway (1A)
Lake Louise
Lake Moraine
Larch Valley
Agnes Tea House
Emerald Lake in Yoho National
Lake O’Hara
Opabin Plateau Circuit
Lakeshore Trail
Bow Lake
Peyto Lake/Peyto Glacier
Athabasca Glacier
Athabasca Fall
93A：Meeting of the rivers
Mt Edith Cavell
Jasper
Maligne Canyon
Medicine Lake
Maligne Lake
Spirit Island
Miette Hot Spring
行程:
Calgary到达，... 阅读全帖 |
|
x**w
发帖数: 112 | 18 实验室有人在用p2A
我老板说p2A比t2A稍好 但似乎都不怎么好
你是要做tracer还是别的 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 19 教你一招，这个不需要啥特殊载体，直接加2A就可以了
2A包括T2A，P2A等等，大多数是十几二十个aa的sequence, 能够
mediate co-translational cleavage，翻成白话就是一个蛋白里面
有这个sequence, 一边翻译一边就被切两半了。你要做的就是表达一
个大蛋白，中间插上2A，表达出来自己就变成四五个小蛋白了，好处
是表达量相同；类似的可以加ires，不过后面蛋白表达量小。
这么多基因怎么clone成一个大蛋白呢并且加2A呢？很简单，google
neb gibson assembly mix就知道了。PCR的时候头上加部分2A sequence，
四五个片段放在一起，加mix "biu。。。"的一声就变成一个片段了，呵呵 |
|
|
m******5
发帖数: 1383 | 21 主要是可靠的DTR序列和T2A序列，版本多得玲琅满目 |
|
m******5
发帖数: 1383 | 22 这个是knock in，所以还是想如果IRES的效率有保证用IRES最靠谱
不过实在不行就冒险上T2A了 |
|
w*e
发帖数: 740 | 23 有正在建2A系统的的么？
我想确认一下我的T2A,P2A的DNA序列是否正确，
网上文章的，还有addgene上的序列都不大一样
谢谢 |
|
w*e
发帖数: 740 | 24 谢谢
我找到了几个文章，也从addgene上搜索到了
但序列比对后，都不一样，
我想用的是T2A,P2A
using |
|
|
w*e
发帖数: 740 | 26 顺便问一个，
但是2A的原理是"ribosome skip",所以在前后两个蛋白的尾巴处都多留了一个或者几个
氨基酸，难道没人怀疑过会这个也许会影响蛋白的功能？ |
|
S*********s
发帖数: 304 | 27 可能会
对于2A前面的蛋白，如果C terminal序列有功能的话，还是用 IRES吧
对于2A后面的蛋白，一般就是Puro或fluoresence protein，关系不大。 |
|
w*e
发帖数: 740 | 28 有的2A后面就是接的是功能蛋白
记得iPS的4个因子的小鼠就是这么造的 |
|
w*e
发帖数: 740 | 29 确切地讲，不是切割
是翻译的时候直接ribosome skipping |
|
|
d**l
发帖数: 1546 | 31 what is your reference? |
|
|
C***2
发帖数: 62 | 33 Hey, I have read several articles using 2A to generate transgenic mouse,
please refer the following articles( I just copy the titles, it is very easy
to search fulltext if you are interesting):
1.High Cleavage Efficiency of a 2A Peptide Derived from
Porcine Teschovirus-1 in Human Cell Lines, Zebrafish and
Mice
2.Correction of multi-gene deficiency in vivo using a
single ‘self-cleaving’ 2A peptide–based retroviral vector
3.Faithful Expression of Multiple Proteins via 2A-Peptide Self-Processing:... 阅读全帖 |
|
s******s
发帖数: 13035 | 34 应该没啥用。根本不是一个promoter，再说puro抗性很强，对dose不太敏感。
这种实验就是做短期的，一两个礼拜内搞定。长期表达不利的shRNA或者转基因，
细胞多半就抑制表达了。有两个办法，一个是连个T2A的抗性，不过细胞其他基
因也可能变化来抵消你得影响；另一个就是做inducible的系统 |
|
d*****i
发帖数: 3905 | 35 请教大牛具体解释下T2A和inducible的系统？？ |
|
C***2
发帖数: 62 | 36 Hey, I am going to generate GeneA+GeneB Knockin mouse in one locus.Furin
cleavage site plus P2A or T2A linker are chosen to link GeneA and GeneB.
This way, co-translation of GenaA and GeneB under endogenous promoter should
be achieved. I googled Furin cleavage site sequence, but i can't find out
accurate and reliable sequence ever used in vivo. So, if someone used or
know furin cleavage site, would you please send me the information and
reference? Moreover, i just read the furin cleavage, do... 阅读全帖 |
|
S*********s
发帖数: 304 | 37 Rudolf Jaenisch lab用T2A, P2A把四个ONSM是个factor放到了一个载体上同时表达四
个ORF.
Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic
vector
Bryce W. Careya,b,
Styliani Markoulakia,
Jacob Hannaa,
Kris Sahaa,
Qing Gaoa,
Maisam Mitalipovaa,1, and
Rudolf Jaenischa,b,1
http://www.pnas.org/content/106/1/157.abstract |
|
s******s
发帖数: 13035 | 38 原来实验室做了几十种promoter，几十种各式tag或者T2A
puro一类的，要表达啥，随便找个tag，promoter，然后去
网上或者facility的library里面挖个基因clone出来，一个礼拜
就搞定，两个礼拜细胞转染好，异常方便。
坏处是，gateway那个酶巨烂，绝对用不到十次。除非
每次做多个克隆，否则用过五六次就失活了，极端怀疑
life里面有猫腻，比如偷偷加了低浓度的蛋白酶一类
很 |
|
T****u
发帖数: 424 | 39 是的~
P2A+T2A+IRES 一下子就4个 |
|
