r******m
发帖数: 173 | 1 I am trying to clone a 300 bp gene into pTYB2 vector (7.4kb)for later
protein purification method by IMPACT-CN. NdeI (producing sticky end) and
SmaI (blunt end) restriction sites were constructed into primers
corresponding to the N- and C- termini of the gene and incorporated by PCR
amplification. The PCR product and the vector were both double digested with
SmaI and NdeI respectively. After gel purification, the digested insert (
gene) and the vector were used to perform ligation with T4 DNA li |
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j****x
发帖数: 1704 | 2 载体外加三个片段，vector-HindIII-insert1-BspEI-insert2-SpeI-insert3-SmaI-
vector
这种连接的效率低是必然的了，而且3’端还是个blunt end（SmaI）。想请教一下有没
有什么tips可以提高成功率？谢谢！ |
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f*********e
发帖数: 43 | 3 Don't lose your heart. If you can't do it try another way. Here is my
suggestion.
You have two fragments. If you have friends do cloning. Ask them what is
fusion PCR? design primers
with overlapping 21 nt, you can do three fragments, take one more that is in
the vector, e.g. lac region
has many restriction sites you can use!!!! do first round PCR separately,
then take a little bit each as
tamplate, use the first primer and last primer with familiar enzymes!!! such
as BamHI, EcorI, SmaI etc. |
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L*****t
发帖数: 56 | 4 老板负责学校一个生物技术课程的教务，自己也会带几个本科生。这次新进实验室的一
位，女，华裔，长相抱歉不过自我感觉良好。第一天参观实验室的时候居然端着一杯咖
啡一边喝一边打招呼，还没来得及阻止就被实验室主任看到了，一通训斥后此人眼望天
空一言不发，反而是我和老板不停的道歉。
第一个实验是LB平板上挑单克隆，此人称自己会做那我就我让她挑3-4个培养。在旁边
看了几秒就发现不对，用来挑菌的枪头居然不换就继续挑下一个，赶快叫停，花了10分
钟解释什么是无菌操作，确定她听懂了后我有事离开一会儿，回来的时候发现实验台上
一堆垃圾，还有一瓶没上盖子的培养液，人早已不知去向。
第二天做酶切的时候再次犯晕，吸过样品的枪头不换直接去吸酶。我指出问题，答曰“
这几个质粒应该都是一样的，为什么要换”。!@#$%^&* 这支全新的SmaI恐怕以后只有
她自己能用了。
双酶切第一步要求25度水浴培育一小时，重复了好几次都切不开，仔细询问后才明白此
人认为25度=室温，就把EP管在室温放了一个小时。问题是实验室常年缺乏日照，异常
阴冷，墙上的温度计显示室温是18度，当然切不开。最后是昨天把一个装着T4 Ligase... 阅读全帖 |
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e****s
发帖数: 1125 | 5 SmaI可以用XmaI代替，就成Stick end了。
3 way ligation做过不少。4个没弄过。 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 6 这要看是什么级别的成功和失败了。一个project，你是对的；一个实验的流程，我说
的没错。
记得刚学做cloning，作一个blunt-end ligation，把PCR产物连到一个vector里。
vector/smaI切后，de-phosph，没连进去。坐下来生了三个小时的闷气，知道错在那里
了。和另一个老博士后一说，她说三小时？以前一个student，三个月没想出来，后来
放弃了。 |
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