y******8
发帖数: 1764 | 1 CMV promoter sometimes is too strong, rather than too week, to avoid
silencing during the process of stable line selection.
A conditional or inducible promoter would be better. |
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y******8
发帖数: 1764 | 2 You might want to use Tet-On or Tet-Off system, if conveniently available.
You could also diminish silencing by addition of insulator sequences to your
promoter. |
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r***e
发帖数: 2539 | 3 说过很多遍了,cmv 在es cell中不行。
用EF1alpha promoter.
G418 |
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s******s
发帖数: 13035 | 4 记得有paper说CMV在ES里面表达N天以后越来越弱，最后几乎被silence掉了。
G418 |
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m******5
发帖数: 1383 | 6 yes, this is actually an advantage of using cmv. if the expression is too
strong, the phenotype might not have anything to do with what happened in
vivo |
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m*****z
发帖数: 1451 | 7 你有在ES细胞里用过tet-on system吗？用的什么promoter？
your |
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y******8
发帖数: 1764 | 8 Not an expert on ES cell. But I think a tet-on line should be available
somewhere. |
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p*******e
发帖数: 14 | 13 不知道我说的对不对，表达量要看你的promotor 用强的，细胞可以用293 或者fb |
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c********b
发帖数: 363 | 14 投Plant Cell只靠GFP fusion蛋白来定位基本不会被接受，除非这个是native
promotor互补的loss of function mutant.至于是不是一定要FISH到不一定。
你这还算快了。我上次投第一审7周，resubmission又是7周。
be |
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n*********p
发帖数: 151 | 15 哦。你说的是GFP带promotor 而不是GFP融合靶蛋白，如果只是GFP本身那当然有问题。 |
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i*********0
发帖数: 915 | 16 我用的是U6 promotor 的载体，不知道能不能拿到stable 的ES cell line，我准备以
后拿这些line做定向分化用。 |
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n********e
发帖数: 1630 | 17 这些信息从哪里知道的？ 我们一直用CMV promotor，但是为什么很强？ 找了半天没找
到 |
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k*****n
发帖数: 323 | 18 不光是myc吧，大家对启动子的认识还是很初级的。哪怕是核心启动子，现在发现都没
有原来想象的那么简单。就拿myc为例子，为什么有Pol II pausing,是怎么被调控的，
好多都不清楚着呢。随着eRNA和promoter的反义RNA 的发现，它们的功能和调控也值得
进一步研究 |
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c******r
发帖数: 3778 | 19 myc基本是个proliferation signal德hub，很多signal最后都是到myc这里，所以调控
太复杂了。 |
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a****d
发帖数: 1919 | 20 H1和U6 promotor 都不能用来过表达蛋白。
FUW TetO是常用的dox inducible overexpression lentivector.这个载体有多个酶切
位点，方便subcloning。我建议sunny老师找Stanford的Wernig lab要一下。 |
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s******s
发帖数: 13035 | 21 不表达的可能性太多，比如缺乏专门的转录因子，或者是Promotor被抑制了，
还有就是enhancer不work，不是完全不表达，而是表达量很低而已。
实际上，你这个reporter如果用带原基因的BAC来做(BAC大一点，上下游的
调控序列多半都包括了），成功的几率大一点。 |
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l******a
发帖数: 3339 | 22 HA-Nter clone 和 HA-Cter clone在同一个vector上？两个promotor，还是怎么做的？
ter |
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r******g
发帖数: 600 | 23 sorry，没有讲明白
2个 独立plasmids,都是retroviral plasmids
promotor是 CMV
最后克隆的两个plasmids
HA-Nter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- N-terimus+Transmembrane domain+a
few more C-ter nucleotides----- IRES------EGFP
HA-Cter
CMV promoter--Multicloning sites--- HA tag- Transmembrane domain+C-terminus-
---- IRES------EGFP |
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发帖数: 1 | 24 不是太懂，为什么Podicin promotor-GFP plasmid必须整合到基因组中才能发绿光呢？
你是要做knockin？ |
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发帖数: 1 | 25 作为一个科研民工，韩论文出来后新闻报道的第一时间就下载了paper看了，当时觉得
这么个学校里这样的条件能出好成果十分不易的，paper里面通篇的实验方法实验数据
都是很朴素的，但整个idea和做出来的结果确十分惊人，就像小成本的高质量电影，让
人看了当时就感叹像是寒门出贵子的感觉，还第一时间和同学分享了这个事情，感到挺
高兴的，结果后来闹成这样，说实话后来韩的反应给人的感觉就完全不是一个搞科研的
人，第一次感觉比较差的就是韩说把质粒提供给addgene了，结果连addgene都能拼成
addgen，这个最常用的质粒数据库不太可能拼错吧，后来有人爆料说派学生去河北他们
实验室要质粒，结果第一次给的质粒没有完整的质粒信息，他们检测发现质粒竟然是原
核表达系统的，怎么做真核编辑？第二次重新要了质粒，测序发现质粒没有promotor和
终止密码子，怎么表达？再后来韩的表现完全是一个政客而不是科研工作者 |
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o**a
发帖数: 86 | 26 Rich
DNA Personals
I've been single-stranded too long! Lonely ATGCATG would like to
pair up with congenial TACGTAC.
>>>>> >
Menage a trois! Ligand seeks two receptors into binding and mutual
phosphorylation. Let's get together and transduce some signals.
>>>>> >
Some dates have called me a promotor. Others have referred to me as
a real operator. Personally, I think I'm just a cute piece of DNA who is
still looking for that special transcription factor to help me unwind.
>>>>> >
Highly sensitive, |
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