p*****n
发帖数: 981 | 1 ☆─────────────────────────────────────☆
tataat (tataat) 于 (Sat Jan 20 23:34:03 2007) 提到:
我用SalI+NotI切一个片断（from a vector). 加了buffer 3和BSA. 结果发现之切了一
刀。于是作了个对照：+SalI only ; +NotI only; +SalI+NotI; +NdeI +NcoI(他们正
好在salI 和 NotI 的外侧，只差十几个bp).
结果：NdeI+NcoI: 切成了两个片断(3+0.4kb)，size都对。所以片断连进去了（pcr+
pgemt，0.4+3.0kb)
+SalI: linearized, only one band(3.4kb)
+NotI: linearized, only one band (3.4)
+SalI+NotI: linearied, only one band (3.4)
实在想不通，难道salI不能和notI混和吗？以前好像也这么干过，没问题的。
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r******m
发帖数: 173 | 2 I am trying to clone a 300 bp gene into pTYB2 vector (7.4kb)for later
protein purification method by IMPACT-CN. NdeI (producing sticky end) and
SmaI (blunt end) restriction sites were constructed into primers
corresponding to the N- and C- termini of the gene and incorporated by PCR
amplification. The PCR product and the vector were both double digested with
SmaI and NdeI respectively. After gel purification, the digested insert (
gene) and the vector were used to perform ligation with T4 DNA li |
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h**********r
发帖数: 671 | 3 最近做一个克隆（NdeI/EcoRI），PCR验证是好好的。用PstI验证也正确。可就是用
NdeI/EcoRI酶切不对。
载体和片段都比预期的要大。而且不知道为啥弥散。
麻烦大家帮忙看一下图吧。多谢！ |
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h**********r
发帖数: 671 | 4 酵母做的少，e. coli做得多点。所以就有问题了。用的基本上是商业化的质粒，pESC-
leu.
问题是看不出来翻译起始位点ATG，而且多种版本的manual上面不提这个问题.不像E.
coli的pET系列,要么在NdeI要么在NcoI.
我是不是把带有ATG的ORF放在多克隆位点就行了？我亚克隆的片段自己有终止密码子，
在此之前也有tag,所以不需要载体的tag。而且载体的tag正好在C端。当然转录方向还
是要看的。
包子伺候！
多谢啊！ |
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