V******t
发帖数: 444 | 1 用BCA？得稀释多少倍啊
2X laemmli buffer： Solution contains 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-
mercaptoethanol, 0.004% bromphenol blue and 0.125 M Tris HCl, pH approx. 6.8.
那么多SDS BME 会干扰啊。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 2 会！
不会酶降解但是会出现化学降解，因为laemmli buffer是一个碱性溶液，会自发水解蛋
白。
不过3个小时应该还有救。如果是过夜，直接扔了算了。 |
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M*****e
发帖数: 279 | 3 Please take a look at the webpage about "Laemmli buffer".
http://www.molecularstation.com/wiki/Laemmli_buffer
The above webpage lists the paper with >17K citations as the right reference.
Laemmli buffer References
↑ Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the
head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685, (1970) Abstract |
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M*****e
发帖数: 279 | 4 大家跑SDS-PAGE时，都要加Laemmli buffer。这种buffer是Laemmli首先配出的。记得
文章不是发表在CNS上的，但是它的引用率“晓东”是望尘莫及的。只是现在很少有人
引用这原始文献了，否则它的引用率会一直高上去。
还有那个qPCR的Delta Delta Ct的方法原始文献引用率应当也不低。 |
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s*********y
发帖数: 387 | 6 Thanks for the infor.
Results as below from Google Scholar
the one you mentioned for methodology is 4k citation comparable to
XiaoDong's case.
"
Peptide mapping by limited proteolysis in sodium dodecyl sulfate and
analysis by gel electrophoresis.
jbc.org [PDF]… , SG Fischer, MW Kirschner, UK Laemmli - Journal of
Biological …, 1977 - ASBMB
THE JOURNAL OF Bm.oorc~~ CHEMISTRY Vol. 252, No. 3, Issue of February
10, pp.
1102-1106, 1971 Prrnfed m USA. ... Peptide Mapping by Limited
Proteolysis in Sodi |
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i******k
发帖数: 4625 | 7 不客气，是我看帖不仔细 :-)
我以前酸性碱性的非变性胶都跑过，碱性的就是通常的laemmli系统不加SDS
不知道你这个urea胶是不是使分辨率更好？
我的印象中urea的本质作用是破坏氢键... |
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k****o
发帖数: 589 | 8
用DSS是为了让抗体不被洗脱，以后还可以重复用agarose beads。交联这一步我是严格
按照厂家的protocol做的。Elution buffer根据厂家描述是酸性，pH2~3。洗脱应该是
没有问题的。洗脱后没有中和pH,但是厂家说这样没有问题。细胞裂解用的是Cell
Signaling的lysis buffer，用来做相同蛋白的WB从没有问题发生过。
你是建议我用Laemmli Sample Buffer洗脱吗？这样即使洗脱，agarose beads也无法重
复用了吧？ |
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M*******C
发帖数: 183 | 9 我看了一下网站，兼容的试剂名单里没有SDS，你用它来做SDS的样品好用吗？
你说的蛋白沉淀下来再测是什么意思？就是裂解-离心-取上清？
比如我的细胞，我加了含SDS的去裂解，为了核蛋白，这样lysate很粘，我就去超声，
等离心后经常看不见沉淀，直接就拿去用了。
The RC DC protein assay is compatible with the following reagents and
buffers in addition to those compatible with the DC protein assay:
CHAPS 2% ReadyPrep sequential extraction reagents 2 and 3
DTT, 350 mM Sodium hydroxide, 2.5 M
EDTA, 0.1 M TBP, 2 mM
Imidazole, 0.5 M Tris, pH 8.4, 0.5 M
Laemmli buffer with 5% β-mercaptoethanol ... 阅读全帖 |
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c********r
发帖数: 1125 | 10
ZHAO KEJI是个很好的励志故事.
他大概是59－60年左右出生的（有可能更老，文革后第一批大学生，年龄具体不知），
78级专科生，昌潍师范学院2年制专科。
82－85年东北师范大学，硕士（化学专业）
88－90年 south illnois大学就读，化学，没有学位（应该是转学了）
这时候他已经最起码30岁了，还没有开始真正的phd学习，甚至学得不是生物，学校更
是不值一提。
后面他开始转运了。。。
90－96 日内瓦大学 博士，老板Ulrich.K. Laemmli。期间一篇embo j,一篇cell。
这个老板应该很多人不陌生，western的buffer应该就是这老头子发明的。
96-99 stanford postdoc，老板crabtree。 一篇cell。
00－ nih pi
他最起码40岁才当上了老板，在30年以前没有任何像样的教育背景和文章。现在他是表
观领域/genomics很出色的老板之一。 |
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i******w
发帖数: 407 | 11 用的是Qproteome Bacterial Protein Prep Kit，里面有Benzonase Nuclease，结果跑
SDS-PAGE然后coomassie染色后，总在最下面几kb左右出现一条超蓝的带。
直接用cell culture加laemmli buffer跑就没有那条带。所以我猜应该是Nuclease。
请问一下谁知道怎么能把protein extract里的Nuclease去掉啊？谢谢 |
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c********r
发帖数: 1125 | 12
Fuchs
你怕啥挨骂啊。。。ETH生物被RU 甩1－2条街完全没有悬念。。。。
我人在瑞士，还是比较了解情况的。
RU的阵容的强大是全美也少见的，诺奖／准诺奖一堆，院士一筐，剩下的基本一大半以
后能上院士。。。而且比例高啊，HMS，UCSF，stanford很多系里面也有相当多的水老
板，RU里面哪有水的啊。。。
瑞士最牛得老板平均能达到RU 平均水平的（Shai Shaham和Kapoor 算是平均水准？）
不会太多，就算超也是超一点的水平，达到在高一档比如Nussenzweig／Vosshal水平的
基本就没几个了。。。。
瑞士真正的顶尖牛人大概也就不到10个，免疫有几个，神经勉强有1－2个，分子细胞发
育有几个，也就这样了。。。
Kurt Wüthrich
Hans Hengartner
Rolf M. Zinkernagel
(上面这几个是炸药）
Ruedi Aebersold
Ueli Schibler
Ulrich K. Laemmli
Michael N. Hall
Denis Duboule
（上面这些是某领域独当一面人物,现在影响力～美国院士水平：也就是RU的平均... 阅读全帖 |
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J*****n
发帖数: 1041 | 13 用TCA沉淀蛋白，溶解蛋白的溶液中有大概1%的去垢剂NP-40，所以在加入Na-
deoxycholate （DOC）就有很多沉淀出来，不知道会不会对蛋白得率有影响？
many thanks in advance!
这个是protocol
1. to one volume protein, add 1/100 volume of 2% DOC, keep on ice for 15 min
2. add 1/10 volume 100% TCA and keep on ice for 1 hr
3. centrifuge at 10,000 g for 10 min at 4C
4. wash the pellet in acetone to get rid of residual TCA
5. resolubilise the pellet in appropriate buffer, and add Laemmli sample
treatment buffer to protein solution
6. SDS-PAGE |
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L*********g
发帖数: 3001 | 14 问一个蛋白磷酸化的问题
要从6孔板里提蛋白，检测磷酸化，由于细胞密度比较低，能否直接把大约200 ul的2 X
laemmli buffer加到孔里，迅速刮下来，然后煮5分钟？整个过程很快，从加buffer到
放到heat block上，在1分钟内完成。
请问，这样做可以么？会不会导致磷酸化消失？
如果这样做不好，还有别的什么办法？
谢谢。 |
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f*******d
发帖数: 92 | 15 这个样做其实对于磷酸化是最好了，这样可以迅速denature所有的蛋白，包括
phosphotase, 从而最大程度上preserve post-translational modification. 只是我
还是会在laemmli buffer里加上protease inhibitors, 煮完之后sonicate, spin down
, bradford，load supernatant. |
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e****s
发帖数: 1125 | 18 好像可以只加SDS来裂解细胞，
SDS在0.1%以下，对检测结果的干扰就不大了。一般测总蛋白，起码稀释100-500倍，
SDS浓度就不高了。跑胶的时候再和正常的Laemmi buffer混起来。
.8. |
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m*******u
发帖数: 173 | 22 pierce 660 nm works well. |
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f*******d
发帖数: 92 | 23 还没有人提到Bca assay reduced sample compatible. |
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g*********r
发帖数: 59 | 25 I used this protocol many years ago. YOu may want to give it a try,
> Load 5ul standards or samples onto NC membrance, air dry for 5min
> wash membrane with 50% Methanol for 5min,
> stain with amido black for 15 min
> wash membrane with 50% Methol for about 30min, until background clear
> air dry for 20-30min ( not too dry)
> cut dot with punch and disolve inabout 200-400ul 0.1N NaOH , dark for
30min, read at 600nm
Good lucks! |
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V******t
发帖数: 444 | 26 不小心放在室温3个小时。没事吧
理论上所有蛋白都变性了吧？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 27 不会，煮过之后理论上蛋白酶都变性了。我经常在室温一放就是一天。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 这样是不对的。正确保存方法是用液氮速冻后放-20度保存。 |
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a******g
发帖数: 71 | 30 peptide bond是amide bond，理论上是非常稳定的，只有强酸或者强碱催化下加热才能
水解，某些特定的序列，比如Asp-Pro这种，可以由于侧链之间的反应导致peptide
bond cleavage，但是即使是这样的反应在室温和偏中性pH下也是很缓慢的。如果SDS样
品煮完之后在一天之内有显著降解那要怀疑一下是不是有什么残存的蛋白酶活性。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 31 学习了，非常感谢！以后还是小心点好。
生物版我喜欢这种帖子，讨厌各种黑啊什么的。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 32 稳定是相对的，降解不全是肽键水解。氧化，交联，异构化，光降解等蛋白降解途径无
处不在。西方杂交特别敏感，很容易产生misleading的数据。
同意胖头鱼的做法，处理完就立即跑胶，否则液氮加低温冰箱保存。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 33 除跑胶这种体力活外，你要多读nih的公开政策，免得被学校老师卖了还不知道。
这里被nih和老板黑过的人多，不免有些怒气。
你老板的经费可以上RO1 report查，可以查到该领域谁的经费最多，谁做得最前沿，或
最实用。 |
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r******k
发帖数: 446 | 37 sunny老师 一定要液氮速冻吗？ 直接放-20 或者-80不行吗？
有的时候有事儿 把lysis 直接放-80 或者-20 第二天再家sds buffer boil 好像也没
啥问题。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 用液氮速冻是为了防止慢慢冷冻的过程中产生盐过浓的现象，这样会促进蛋白水解。 |
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r*******y
发帖数: 48 | 39 Just freeze it at -20 is fine. |
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g*****n
发帖数: 241 | 40 目标蛋白的分子量应该是80KDa，做了western发现90左右有带，然后250附近也有带，
而且这两条带在null mutant里面都没有，应该是specific的。但为什么会有这么大分
子量的带呢？就算是三聚体的话在变性条件下应该也解聚了吧？
PS: 我用的是Laemmli sample buffer with DTT和SDS，95度5分钟，然后离心之后上样
。用的是NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gel以及NuPAGE MOPS SDS running
buffer。
谢谢大家 |
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