b*****s
发帖数: 169 | 1 做酶切鉴定或是测序，我从来不用kit，效果是good enough，已经测序有近2000个样品
了。只有做转染才用kit。
我的方法是挑菌落到1ml LB in 1.5ml eppendorf tube, culture for 16h, 吸取50-
100ul culture in 96-well plate 放在4oC 用于以后正确克隆的扩大培养。离心
13200rpm for
0.5min. The pellet is resuspended in 200ul P1, then P2, then P3, spin at
13200rpm for 15min after stored at 4oC for 30min. add equal volume
isopropanol to the supernate in a new tube, spin for 15min, wash with 70%
ETOH. 然后溶于50-100ul水或是TE即可，浓度在150ng/ul 左右。一天做96个克隆是不
难的。
这种样品测序时我试过两个公司，同一样品，genewiz可以得到23个有用的... 阅读全帖 |
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s******r
发帖数: 1245 | 2 找genscript或者genewiz，都是老中的公司，都能讲价
10kb的可能太长，可以合成两个5kb或者几个3，4k的自己回来拼一下，个把月应该能搞定
Which |
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s******r
发帖数: 1245 | 3 找genscript或者genewiz，都是老中的公司，都能讲价
10kb的可能太长，可以合成两个5kb或者几个3，4k的自己回来拼一下，个把月应该能搞定
Which |
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p*******e
发帖数: 33 | 4 感觉业务能力一般就早点学其它的.
这个样子,没有好运气是进不了公司的.
当然,这几年好些个同胞开的CRO,什么GenScript Genewiz BGI,就是这边接活回国做的
那种.
工资福利都很一般,不过也算是不在实验室做了. |
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s******r
发帖数: 1245 | 5 这个不用担心吧，回国之后周围问一圈就知道了
做DNA合成的genscript,genewiz啥的都是国内公司 |
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d***i
发帖数: 20 | 8 我的条件倒是挺符合的，请问genewiz家支持H1B么？ |
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v**********m
发帖数: 5516 | 9 genscript, 版上推荐过。Genewiz 听说有人用过。
呵呵，老板肯定觉得你们更省钱。千老就是一双便宜的手，老板觉得不用就亏了。 |
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n**u
发帖数: 87 | 10 chose different protocol
chose different primer
do RELP check by yourself
：最近一段时间似乎质量非常差。所有的结果都是no priming。我的质粒浓度用
nanodrop测过，也根据他们的要求调整了。还是大批大批的no priming。
： |
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v**********m
发帖数: 5516 | 11 GC 高的序列在测序反应里加点DMSO， 借以降低退火温度要求。通常测序公司会有阳
性对照来做质量控制，体系不会出大问题。你甚至可以要求他们把系统质量控制的结果
发给你。
nanodrop
technologies |
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a****d
发帖数: 1919 | 12 no problem so far with my samples |
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e********h
发帖数: 694 | 13 他们一般会给一个free repeat，你让他们先free repeat一个样品，如果结果很好，他
们会免费把所有样品重新测一次。
我曾有过类似经历
nanodrop
technologies |
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T*****e
发帖数: 247 | 14 谢谢楼上各位的建议！
nchu：
protocol我不知道怎么让公司换。primer已经换过了还这样。RELP是什么？谢谢！
varianinccom：
他们就是质量控制发现绝大部分sample都很差。我在他家用了四年多了吧。这是第一次
这样大规模的出错。关键是这个测序的部分非常简单。invitrogen的pCR8GWTOPO，普通
的TOPO cloning vector。用通用的M13 primer测序，这个结合位点是在TOPO vector载
体上的。我只是插入PCR产物进去，跟引物结合位点还差了100bp以上呢。至于你提出的
加DMSO，我这种估计得专门跟他们沟通才敢加吧。
atwood：
我在他家以前一直也没啥问题，就最近两个星期。所以我才来这问的。不过你说没有问
题，那我再找找自己的原因。
extinguish：
有个别的sample用了free repeat了，还是不行。即使是测载体自身序列部分也有突变
。我就搞不明白这些突变是从哪来的了。
再次感谢大家的帮助！ |
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x********e
发帖数: 35261 | 15 我有段时间这个问题很严重。后来发现是质粒太大（>8k）导致的。最简单的解决方式
就是用M13F&R做PCR然后简单提纯送PCR产物去测序。 |
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n**u
发帖数: 87 | 16 chose custom, and the last column is where you can choose different protocol
. change primer to different location, like 200bp up or downstream.
：谢谢楼上各位的建议！
： |
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h***e
发帖数: 7320 | 17 我去年也有不少non priming.. 被整惨了。。那时候刚好怀孕，老板用这个无理取闹，
非想要炒掉我
现在看看大家的情况，顿时知道了问题所在 |
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y*****u
发帖数: 31 | 18 去年用过一阵子，也是同样的问题。后来找了一个办法，解决了一部分问题。就是完全
按照他们要求的QUANTITY送样本，我以前为了样本损耗的问题，样本会寄3-5倍高于要
求的量。我同事说这些公司的技术员就是机械操作，不会去帮你测算QUANTITY的，他们
ASSUME你寄的完全就是他们的PROTOCOL 要求的量。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 19 我们实验室也有一模一样的经历！也是去年下半年开始突然出现的！
我们一开始以为是我们自己的问题，但是折腾了一个多月没有改善，后来我们干脆就换
公司了。
我怀疑他们的技术人员换了，或者来了一个新手。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 21 如果测序系统的质量控制实验结果通不过，那正常做法是不应该给客户任何结果，而
是先校正系统，把质量控制做过关，再做客户样品。
公司的内部质量管理出大问题了，这么做要把公司的牌子做废掉。 |
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h****n
发帖数: 2552 | 23 一样的有这个问题。我专门和他们客户讨论过，解决方案就是选difficult template的
同时还要注明用：alternative protocol。但是这样你会多付一些测序费用，如果有更
好的选择的话，还是别用这家公司了。 |
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m******h
发帖数: 5753 | 24 同样的感觉，mutagenesis，跟他们做了很多，从去年开始， 周期长，总出错。年前的
一个到现在也没做完。 |
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w*********3
发帖数: 217 | 26 我推荐一个 wyzerbio, Tony Li很好打交道。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.6 |
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b*****l
发帖数: 491 | 27 我们已不用他们的服务了，经常出现这个no priming. 有时候同一个载体和引物上一次
给你很好的结果。下一次就no priming了。
赶紧换
nanodrop
technologies |
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s******y
发帖数: 28562 | 28 你们来说这种没有营养的话是没有用的，如果真的要把客户们找回来，我的建议是立刻
把你们现在的技术人员给炒了，然后把你们一年以前的那批技术人员给请回来。
说实话，虽然我们也会看价格，但是如果服务质量不好以至影响到了我们的项目进程，
就算价格再低我们也不会用的。 |
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l***y
发帖数: 638 | 29 测序又不是什么技术活做这个的遍地都是，这家不行换一家不就好了，费那么大劲干啥 |
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n**u
发帖数: 87 | 30 chose different protocol
chose different primer
do RELP check by yourself
：最近一段时间似乎质量非常差。所有的结果都是no priming。我的质粒浓度用
nanodrop测过，也根据他们的要求调整了。还是大批大批的no priming。
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v**********m
发帖数: 5516 | 31 GC 高的序列在测序反应里加点DMSO， 借以降低退火温度要求。通常测序公司会有阳
性对照来做质量控制，体系不会出大问题。你甚至可以要求他们把系统质量控制的结果
发给你。
nanodrop
technologies |
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a****d
发帖数: 1919 | 32 no problem so far with my samples |
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e********h
发帖数: 694 | 33 他们一般会给一个free repeat，你让他们先free repeat一个样品，如果结果很好，他
们会免费把所有样品重新测一次。
我曾有过类似经历
nanodrop
technologies |
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T*****e
发帖数: 247 | 34 谢谢楼上各位的建议！
nchu：
protocol我不知道怎么让公司换。primer已经换过了还这样。RELP是什么？谢谢！
varianinccom：
他们就是质量控制发现绝大部分sample都很差。我在他家用了四年多了吧。这是第一次
这样大规模的出错。关键是这个测序的部分非常简单。invitrogen的pCR8GWTOPO，普通
的TOPO cloning vector。用通用的M13 primer测序，这个结合位点是在TOPO vector载
体上的。我只是插入PCR产物进去，跟引物结合位点还差了100bp以上呢。至于你提出的
加DMSO，我这种估计得专门跟他们沟通才敢加吧。
atwood：
我在他家以前一直也没啥问题，就最近两个星期。所以我才来这问的。不过你说没有问
题，那我再找找自己的原因。
extinguish：
有个别的sample用了free repeat了，还是不行。即使是测载体自身序列部分也有突变
。我就搞不明白这些突变是从哪来的了。
再次感谢大家的帮助！ |
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x********e
发帖数: 35261 | 35 我有段时间这个问题很严重。后来发现是质粒太大（>8k）导致的。最简单的解决方式
就是用M13F&R做PCR然后简单提纯送PCR产物去测序。 |
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n**u
发帖数: 87 | 36 chose custom, and the last column is where you can choose different protocol
. change primer to different location, like 200bp up or downstream.
：谢谢楼上各位的建议！
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h***e
发帖数: 7320 | 37 我去年也有不少non priming.. 被整惨了。。那时候刚好怀孕，老板用这个无理取闹，
非想要炒掉我
现在看看大家的情况，顿时知道了问题所在 |
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y*****u
发帖数: 31 | 38 去年用过一阵子，也是同样的问题。后来找了一个办法，解决了一部分问题。就是完全
按照他们要求的QUANTITY送样本，我以前为了样本损耗的问题，样本会寄3-5倍高于要
求的量。我同事说这些公司的技术员就是机械操作，不会去帮你测算QUANTITY的，他们
ASSUME你寄的完全就是他们的PROTOCOL 要求的量。 |
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s******y
发帖数: 28562 | 39 我们实验室也有一模一样的经历！也是去年下半年开始突然出现的！
我们一开始以为是我们自己的问题，但是折腾了一个多月没有改善，后来我们干脆就换
公司了。
我怀疑他们的技术人员换了，或者来了一个新手。 |
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v**********m
发帖数: 5516 | 41 如果测序系统的质量控制实验结果通不过，那正常做法是不应该给客户任何结果，而
是先校正系统，把质量控制做过关，再做客户样品。
公司的内部质量管理出大问题了，这么做要把公司的牌子做废掉。 |
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h****n
发帖数: 2552 | 43 一样的有这个问题。我专门和他们客户讨论过，解决方案就是选difficult template的
同时还要注明用：alternative protocol。但是这样你会多付一些测序费用，如果有更
好的选择的话，还是别用这家公司了。 |
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m******h
发帖数: 5753 | 44 同样的感觉，mutagenesis，跟他们做了很多，从去年开始， 周期长，总出错。年前的
一个到现在也没做完。 |
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w*********3
发帖数: 217 | 46 我推荐一个 wyzerbio, Tony Li很好打交道。
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.6 |
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b*****l
发帖数: 491 | 47 我们已不用他们的服务了，经常出现这个no priming. 有时候同一个载体和引物上一次
给你很好的结果。下一次就no priming了。
赶紧换
nanodrop
technologies |
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s******y
发帖数: 28562 | 48 你们来说这种没有营养的话是没有用的，如果真的要把客户们找回来，我的建议是立刻
把你们现在的技术人员给炒了，然后把你们一年以前的那批技术人员给请回来。
说实话，虽然我们也会看价格，但是如果服务质量不好以至影响到了我们的项目进程，
就算价格再低我们也不会用的。 |
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l***y
发帖数: 638 | 49 测序又不是什么技术活做这个的遍地都是，这家不行换一家不就好了，费那么大劲干啥 |
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s******r
发帖数: 1245 | 50 直接找它家对头genscript要盒子，颠儿颠儿的就给你设好了 |
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