l**********k
发帖数: 189 | 1 我看到你前面发过一个帖子，说看不到cre表达。我说说我的理解。不知道对不对。
1）你这个方法说不上把A本身的ATG破坏掉。也可以说你的Cre利用了A基因的ATG。理论
上这样设计没有问题。
2）Cre只有Stop codon，没有pA，也没有问题。因为基因转录时候mRNA拼接，后面会有
A基因自己的pA。
3）这个设计当然表达Cre自己，不会表达融合蛋白。即使核糖体见到Stop codon没有掉下
来，可能因为不可知的原因滑到了下一个ATG，表达了另一个蛋白，对Cre自己来
讲，也是一个单一的蛋白。
4）理论上只要Cre有一点表达，即使比较弱，你的Reporter总是能够给你一些信号的。但
因为你说没有任何信号，所以说明Cre根本就没有表达。
但是什么原因不表达呢？我能想到的有4种可能行
A) Cre有突变。但可能性不大。相信不表达的话，你首先会想到测序。这个应该
被你排除了。
B) 启动子不全。做为BAC，这种可能性有（如果基因横跨上百kb,或几百kb)，但
... 阅读全帖 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 2 sunny 老大和 长木行 longwoodwalk 不熟吗 in 2008 or 09 ?
LZ please refer
同主题阅读：Re: 这样构建bac，可行不？
[版面:生物学][首篇作者：longwoodwalk] , 2011年06月04日23:37:27
[分页:1 ]
longwoodwalk
[ 2 ]
发信人: longwoodwalk (长木行走), 信区: Biology
标 题: Re: 这样构建bac，可行不？
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Jun 5 11:34:27 2011, 美东)
如果是这样的话，又多了一种可能性。在mRNA上，不是所有情况下第一个ATG
都是起始密码子。前后的序列，比如Kozak序列，才是决定mRNA从哪里开始翻
译的起始位点。我怀疑还有一种可能性，因为你们破坏了A本身的ATG，Cre放
在了20bp之后。有可能Cre自己的ATG不能作为kozak或类似序列，所以，不能
被核糖体视为一个ORF的start codon，所以不能表达你的Cre。再往后面的
ATG, 即使有可能被视做一个ORF的起始密码字，... 阅读全帖 |
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D*a
发帖数: 6830 | 3 那你就是看到loxp了，那怎么也变不成3里面那个只少了个loxp的啊。你用p3p4怎么也
出不来wt allele啊，什么叫“两个分得很开”？
你说看到exon1了是有多清楚？你原帖的意思是读不下去了，我理解是两个以上不同碱
基的峰，你是这个意思吗？那这里看到exon1又是什么意思?
你把产物多长该从哪里读多长实际看到什么多长画画吧，图上没有比例不知道怎么说 |
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G***G
发帖数: 16778 | 4 today I argued in one student's presentation about exon array with
friend.
given exon 1, exon 3 are up-regulated between cancer and normal,
but exon 2 are not up-regualted.
can we say we find exon1+exon3 junction?
My answer is no. but my friend said yes.
what is your answer?
if we want to find exon 3 and exon 18 splicing juntion,
does that mean we need to find exon 3 and 18 upregulated and 4 to 17 down-
regualted?
note: we are talking about only exon array not exon-exon array here. |
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a***e
发帖数: 1010 | 5 the answer is no. think about these possibilities:
(1) the exon 1 probe of the gene A also recognizes gene B, and the exon 3
probe of the gene A recognizes gene C. In cancer cells, gene B and C go up.
(2) there are alternative promoters and termination sites for exon 1/2/3
you have to identify the actual sequence of exon1-exon3 to make sure there
is a junction. |
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c*t
发帖数: 1063 | 6 一个dominant的老鼠，heterozygous breeding female根本不怀孕，所以无法得到
homozygous的老鼠。现在只能用heterozygote来找mutation。并且位点在比较大的
intro上，如何找这个mutation呢。。
大概图（exon 2 and 3 deletion）
exon1（70） （intron 60k） exon2（1800） exon3（400） （intron 20k） exon4
（140）。
欢迎各位前辈指教.
谢谢！！！ |
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C***N
发帖数: 200 | 7 我想研究基因SLC6A3的promoter的调控功能，在pubmed上只有exon1之后的序列，如何
找到promoter的序列？
谢谢。 |
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w****u
发帖数: 1078 | 8 Thank you for those two replied.
However, I do not know 聚合酶2的峰值位置，组蛋白修饰，转录因子结
合?
2) gene 5‘end的序列 is before which exon? Some literatures said is before
exon1. But my boss thought it is before ATG.
3) also, based on Ensemble transcripts, there are 4 different transcripts.
Every one has different start exon. in this situation, which is correct?
thanks |
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Z******5
发帖数: 435 | 9 1）However, I do not know 聚合酶2的峰值位置，组蛋白修饰，转录因子结合?
A.这个说起来比较复杂。
a. 和转录起始位置相关的一些组蛋白修饰看这篇文献 The mammalian epigenome.
Cell. 2007 Feb 23;128(4):669-81.
b. 聚合酶2的我忘了哪篇文献了，不过很好理解，基因的转录肯定需要聚合酶2的
结合，自然就会有聚合酶2的结合ChIP数据。你可以去UCSC随便找几个熟悉的基因看看
，比如GAPDH等。
c. 转录因子的ChIP在UCSC genome browser上的数据是有限的，现在已经有几十个
转录因子了吧，这个只是参考。还是那句话，找个你熟悉的基因，看看周围的结合情况
就知道了。
d. 再提一下RIKEN的问题，你可以参考下面几篇文献
Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of
transcriptional starting point and identification of... 阅读全帖 |
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y*********u
发帖数: 183 | 10 Thank you! what I did is completely replaced the exon1, exon2, and intron1
Do you think we need to add an exogenous pA signal in this case?
I added it anyway
it |
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y*********u
发帖数: 183 | 11 We replaced the part of exon1,and exon2, do you think the endogenous pA
would work in this case? And could you post a link regarding the case of
utilizing the endogenous pA ?
it |
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y*********u
发帖数: 183 | 12 that is also how I figured it, I designed such a knock in animal by
replacing the whole exon1 and exon2 (keep some flanking sequence as splicing
context) without additional polyA signal. I am hoping it would work
binding |
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y*********u
发帖数: 183 | 13 如图
我要knock in表达的原基因有4个exon，我想插入一个EGFP reporter
，于是把exon1和exon2 replace掉（留下一小部分flanking sequence）
因为这个基因的3'UTR的调控做得很热，因此我就不能引入外源polyA 比如SV40, BGH
polyA等
粗看过去似乎问题不大，我用的EGFP的编码做过修改不含有splicing context
但是也有人说不加外源polyA的knock in表达很靠运气？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 14 Exon1上有个alternative transcription starting site…… |
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t******y
发帖数: 716 | 15 请问谁碰到过类似的情况？
一个转基因老鼠，目标基因A的exon 1被lacZ基因取代。但是从突变体纯合子分离到的
原代细胞里还是能够检测到目标蛋白A的表达。用qPCR检测目标其mRNA水平虽然要比野
生型少很多，但是也能够检测得到（大概是野生型的百分之五左右）。exon1包括翻译
起始位点ATG以及后面大概250个碱基。此突变体纯合子表型明显，杂合子没有表型。 |
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b******n
发帖数: 4225 | 16 你突变体纯合子能被抗体检测，是western还是免疫组化？
突变体纯合子的mRNA可以做primer extension，看看是不是有alternative start
codon
想降低qPCR本底水平，引物可以设计一端priming在exon1，另外一端在别的exon或者5'
-UTR |
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c****l
发帖数: 1086 | 17 这不是很正常吗，你的ko可能是in frame 的exon 1 replacement，蛋白的其他domain
还在， 如果你的抗体是polyclonal或是别exon1以外的epitope，当然可以监测到了 |
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H*H
发帖数: 472 | 18 此人感觉已经精神分裂了！
看你发的帖子，你自己是做老鼠转基因的！还要装成自己不是搞生物的，然后大义凛然
的样子。。。。。
如果没搞错的话， 这是你发的帖子吧。。。
“请问谁碰到过类似的情况？
一个转基因老鼠，目标基因A的exon 1被lacZ基因取代。但是从突变体纯合子分离到的
原代细胞里还是能够检测到目标蛋白A的表达。用qPCR检测目标其mRNA水平虽然要比野
生型少很多，但是也能够检测得到（大概是野生型的百分之五左右）。exon1包括翻译
起始位点ATG以及后面大概250个碱基。此突变体纯合子表型明显，杂合子没有表型。
” |
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G***G
发帖数: 16778 | 19 where to find all exons/introns for a gene?
I am looking for informations about exons/introns for a gene,
not for one of its transcripts.
For example, given a gene, can we tell how many exons it has totally?
What is exon1 and what is exon2? |
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m****M
发帖数: 360 | 20 你的P３肯定在GFP上吧？你用P３和P４扩heterozygous只能扩出一个targeted allele
呀。不可能扩出Wildtype allele呀。用P１做测序引物，前面一点肯定是Wildtype序列
呀（不太确定具体多长，也不确定你具体短到何种程度，看到Exon1了吗？）。我建议
你在GFP后面的序列上设计两个相反的引物进行分别测序 |
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j**W
发帖数: 89 | 21 用P１做测序引物，过了该是loxP的还是Wildtype序列。看到Exon1了。所以我觉得我实
际上是造了我图上画的mis-targeted allele 了。多希望自己interprete错了呀。
allele |
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f*****f
发帖数: 195 | 22 谢谢。假如我希望表达fusion protein，不是用2A-GFP或ires，比如如上所面帖子，
ATG-GFP-exon1-...即把gfp插入到第一个exon之前可行么？另外，可以把GFP序列插入
到最后一个exon之后。在体外瞬时转染，gfp放在N或C端有时会影响蛋白自身，一般做
knockin的话，该如何选择？为规避这种，还是knockin一般用小tag的多？比如flag，
v5等等。 |
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