d********n
发帖数: 15 | 1 我一直用qiagen的盒子，开始出现过这样的问题，但后来解决问题后，DNA回收基本没
出现过什么问题。解决如下：
1. 不要按说明书的那个比例加溶解液，只要加1~1.5倍的体积即可。这是因为3倍体积
过多的体积会dilute DNA，DNA与柱子结合是浓度依赖性的，所以浓度越高越好。我只
在第一次成果gel的重量，but never did it again. 目测体积即可，大部分gel淹了就
行。 只要略延长incubion时间，用手指多弹几次，都能溶解。
2. 3M 醋酸钠(pH5.01)是必须的，（有时候，还吸1~2ul到试纸条上确认ph在酸性范围
内）。要保证黄色。由于上面的溶解液不是按标准的，所以酸度会被稀释。所以，无论
怎么样，“ 1/10 3M 醋酸钠” 只会有益无害。
3. Add ~50% isopropanol and mix well.
4. 低速过柱，5000~8000gx30sec, 防止过快，DNA没有足够的机会结合柱子.
5. 洗柱后，20000gx2min充分干燥柱子。防止残留成分改变H2O的成分而影响elution。
大概这样，你可以试试看。个人认为q... 阅读全帖 |
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h**********r
发帖数: 671 | 2 化完胶之后，一定要等solution凉下来，再loading到柱子上。着急的话在冰上放一小
会儿。另外loading在柱子上放一小会儿，等吸附平衡。加NaAC好用，大多数时候偷懒
没加。
想增加回收率的话，可以考虑一下稍微共加热一下elution buffer。然后还是放一下会
儿。
总之就是偏酸吸附，偏碱解附；低温吸附，高温解附；高盐吸附，低盐解附。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 3 我已经把kit从genejet全部换成了zymo的，优势有几点
1.操作时间和操作量至少减半，要是经常做几十个sample的感觉上区别就大了。
2.小体积elute优势太大了，我可以回收genotyping的胶条带送去测序。
3.价格不错
不明白qiagen这样的公司怎么还能活着，也许习惯是可怕的。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 4 另外楼主的情况有可能是溶胶buffer PH不对导致挂柱不好，或者因片段较大需要在
elute的时候
加热EB以及延长时间。
以前用过qiagen的kit，回收效率80%是能达到的，用dna ladder测试的
概1 |
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s******s
发帖数: 13035 | 5 Qiagen胶回收的最大问题不是回收效率，是脏。
我都是30+50 elute两次下来，再过一遍minElute浓缩纯化
20 |
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x********e
发帖数: 35261 | 6 你们胶回收都能达到多少的recover rate？基本上kit都会说自己的recover rate能达到
80%以上。但是我一般只能回收30%
Qiagen胶回收的最大问题不是回收效率，是脏。
我都是30+50 elute两次下来，再过一遍minElute浓缩纯化
20 |
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d********n
发帖数: 15 | 7 我一直用qiagen的盒子，开始出现过这样的问题，但后来解决问题后，DNA回收基本没
出现过什么问题。解决如下：
1. 不要按说明书的那个比例加溶解液，只要加1~1.5倍的体积即可。这是因为3倍体积
过多的体积会dilute DNA，DNA与柱子结合是浓度依赖性的，所以浓度越高越好。我只
在第一次成果gel的重量，but never did it again. 目测体积即可，大部分gel淹了就
行。 只要略延长incubion时间，用手指多弹几次，都能溶解。
2. 3M 醋酸钠(pH5.01)是必须的，（有时候，还吸1~2ul到试纸条上确认ph在酸性范围
内）。要保证黄色。由于上面的溶解液不是按标准的，所以酸度会被稀释。所以，无论
怎么样，“ 1/10 3M 醋酸钠” 只会有益无害。
3. Add ~50% isopropanol and mix well.
4. 低速过柱，5000~8000gx30sec, 防止过快，DNA没有足够的机会结合柱子.
5. 洗柱后，20000gx2min充分干燥柱子。防止残留成分改变H2O的成分而影响elution。
大概这样，你可以试试看。个人认为q... 阅读全帖 |
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h**********r
发帖数: 671 | 8 化完胶之后，一定要等solution凉下来，再loading到柱子上。着急的话在冰上放一小
会儿。另外loading在柱子上放一小会儿，等吸附平衡。加NaAC好用，大多数时候偷懒
没加。
想增加回收率的话，可以考虑一下稍微共加热一下elution buffer。然后还是放一下会
儿。
总之就是偏酸吸附，偏碱解附；低温吸附，高温解附；高盐吸附，低盐解附。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 9 我已经把kit从genejet全部换成了zymo的，优势有几点
1.操作时间和操作量至少减半，要是经常做几十个sample的感觉上区别就大了。
2.小体积elute优势太大了，我可以回收genotyping的胶条带送去测序。
3.价格不错
不明白qiagen这样的公司怎么还能活着，也许习惯是可怕的。 |
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m*****z
发帖数: 1451 | 10 另外楼主的情况有可能是溶胶buffer PH不对导致挂柱不好，或者因片段较大需要在
elute的时候
加热EB以及延长时间。
以前用过qiagen的kit，回收效率80%是能达到的，用dna ladder测试的
概1 |
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x*********a
发帖数: 24 | 11 一直在尝试做Hsp90 IP的实验，一直失败ing。
我把我做的实验条件贴出来，感觉版上的人都很热心，希望大家能指点迷津，多谢了。
裂解细胞，我一开始用的是invitrogen的M-PER buffer,后来看文献改成了NP-40的
buffer， NP-40的浓度时1%。
immunoprecipitation用的是life technology的kit，Dynabeads ProteinG， magnetic
beads。Hsp90的抗体用的是anti mouse的单抗 IgG2a.
我先将lysate跟antibody Hsp90（100:1） 混合，4度摇一个小时，然后加beads
incubate overnight。第二天wash 三次，然后用kit 里面的elution buffer加loading
dye 90度10min中，然后跑胶做western。
wash buffer本来用的是PBS，后来改成了cell signaling 买的kinase buffer， 里面
含 25 mM Tris-HCl, 5 mM glycerophosphate, 2 mM DTT,... 阅读全帖 |
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w********a
发帖数: 324 | 12 一直以来的一个问题：
PCR产物如果用Qiagen kit切胶提纯后，再作为Template,用Neb的Q5或者Phusion继续做
PCR （尤其条带比较长的时候），经常做不出来。打电话问了一下Neb的technician。
他们说他们也发现了这个问题
。他们觉得可能是Qiagen kit提纯后，最后的elute里面有某种inhibitor影响了后续
PCR的反应。但是他们也没有想出有效的办法来解决这个问题。
不知道版上的牛牛们有没有遇到类似的问题？是怎么解决的？另外，有别的公司的Gel
extraction kit会避免这个问题吗？
多谢！ |
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a*******a
发帖数: 4233 | 13 最后一步你用水还是elution buffer?
我猜用水就好了
Gel |
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H*g
发帖数: 2333 | 14 It may be due to the remaining agarose and its residues in the elution. Try
Qiagen PCR Purification Kit to purify your products. It may solve your
problem.
Gel |
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m*********D
发帖数: 1727 | 15 Elute by ddH2O? pH could affect the ratio. So use TE buffer to measure O.D.
again. |
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h*********g
发帖数: 18 | 16 Yes, I eluted by ddH2O. So I should use TE buffer to elude? I will use it to
make RNA. Can I still use the DNA to make RNA? Thanks.
. |
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m******t
发帖数: 109 | 17 想知道FLAG 纯化出来的蛋白还有没有activity? 如果用3.0酸elute的话 |
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L****T
发帖数: 169 | 18 谢谢！Dyanbeads和Stem Cell Technology没有我要的抗体，多了一步生物素标记的一
抗。你说的那个磁柱一直结合在细胞上确实是个问题，需要用个合适的溶液elute掉，
酸洗一下不知道对细胞杀伤会不会太大。
Technology |
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s********r
发帖数: 312 | 19 Zymo的miniprep的yield比qiagen的低20-30%，但也肯定够用了。他们的pcr和gel纯化
kit很好用，可以用很小的体积elute，做克隆非常方便。 |
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H****s
发帖数: 301 | 20 我来抛砖引玉吧：
（1）streptavidin+biotin的结合够强壮么？
够！非常够。
（2）在wash和elute的时候，有特定的或者通用的条件可以用吗？
这取决于A和C的结合强度，所以，怎么洗，怎么洗脱需要摸条件。
（3）请问有商用的sepharose-streptavidin推荐么（或者其他avidin variants
conjugated to agarose or sepharose beads）？
你可以试试Miltenyi的streptavidin microbeads或者其它品牌的，非常多。这个技术
比较成熟，基本的protocol可以在文献中很容易找到。
最后，需要考虑的是：你怎么保证商用的biotinylated protein A仍然具有protein A
的生物学活性？或者说biotinylation不会影响到A/B/C/D的结合？
protein |
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s******s
发帖数: 795 | 21 谢谢楼上的回答，10个包子奉上。话说，你的ID。。。。。。
1.结合力够强就好。那我的设计思路基本可行了！
2.washing和elution肯定要摸条件。这个我有心理准备。
3.谢谢，我去多挖挖文献。
4.你的point我get了：）。。。这个没法保证。protein A是个肽段，老板要我不考虑
生物学活性了，只管相互作用（我倒，这还是做science么，不过老板就这样说滴。不
过其实把这个肽段跟biotin共价结合或者直接偶联到sepharose上，或者任何其他偶联
操作，说不定就已经改变了其功能了，所以。。。就不考虑那么多了）
Any input is welcome！有搞过类似的，直接给产品+protocol信息吧，包子求！ |
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r******g
发帖数: 600 | 22 超级好用，木有啥缺点
跑完柱子，elute出来，直接precipiate了就可以 transfection |
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l**********0
发帖数: 216 | 23 问题太初级，beads先用loading buffer （一般tris， pH 8， 加150 到500 mM 氯化
钠，如果目标蛋白有free的Cys加10 mM b-Me，如果需要加detergent，还可以适当加20
mM imidazole）处理，去掉ethanol，再mix and bind your protein, then elute |
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s********r
发帖数: 312 | 24 Use DNA concentration kit to purify your PCR product, elute in 45ul of H2O,
check concentration. Then cut PCR product for 3 hours, gel purify, ligate
and transform. |
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f*****r
发帖数: 84 | 25 要做一个screen 然后sequence plasmid library. 所以小含量的gDNA 会比较影响结果
。 大家有什么比较好的方法除去gDNA 么。 是不是大片段dna 在cartridge 上elute
就不容易， 这样我再做一个pcr clean up 是不是gDNA 会去掉很多。
thanks! |
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j****n
发帖数: 3370 | 26 用exonuclease切一切会不会有效果？
elute |
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t******5
发帖数: 67 | 27 gDNA 分子量非常大，如果抽提过程中动作轻柔的话gDNA不会裂成小片段，再跑胶回收
就能去除gDNA
elute |
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y*****g
发帖数: 40 | 28 miniprep的elution buffer好像不是TE，还是冻起来的好。
在TE里面很稳定。 |
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H*******i
发帖数: 196 | 29 TE会影响Mg2+活性，如果要大量酶切之类的，影响下一步实验，所以elution buffer就
是简单的tris buffer之类的 |
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f******k
发帖数: 856 | 30 我这个问题很奇特，我用Invitrogen的dynabeads做ChIP-seq，最后拉下来的DNA量总是
比较高，做qPCR也没有enrichment，但是用同样的protocol，换回agarose beads，就
很少碰到这种问题。这不合理啊，dynabeads按理说背景要比agarose beads低很多才对
啊？！不知道大家有没有碰到这种情况？我试过好几种洗的方法和试剂，比如最常用的
就是低盐洗一次，高盐洗一次,LiCl洗一次，TE洗两次。也试过用RIPA洗过，也试过大
量延长洗的时间，但是最后elute下来DNA的量还是比较高。
另外，能不能请推荐一个比较好的做转录因子ChIP-seq的盒子或者详细的homemade
protocol？我做的这个转录因子，比较low abundant，可是我的材料是primary tissue
，又没法一次拿到很多的细胞（一次运气好的话可以有50-100million）。看有的文章
说现在10million就可以做转录因子的ChIP-seq了，可是我从来没成功过。现在真是快
被逼死啦。。。。快救救我 ：（ |
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l******3
发帖数: 24 | 31 以前的实验室，将异丙醇放在冰上，让elution buffer 滴到异丙醇中，然后wing离心
机4000rpm 30min。一直效果不错。 |
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s*****y
发帖数: 4595 | 32 同时有没有run UV/PDA? 如果UV看着正常，有一种可能是有其他ptoton affinity很高
的东西和你要的峰co-elute了。 |
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p**********m
发帖数: 472 | 33 我的条件.
column 250mm*21mm C18.
mobile phase methanol and 0,1% formic acid.
injection volumn: 2ml.
injection mass: 100mg
elution condition: 5%-90% 30min and hold 90% 8min |
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l*******n
发帖数: 2718 | 35 check the flow rate. If flow rate is acurate, then nothing to worry. Your
column is cleaner after some junk is eluted out. |
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S******G
发帖数: 965 | 36 Be careful of this reagent. I have used a lot of them in graduate school and
now I think I could have used more precaution. This thing is nasty.
as Chaogong said, you can use an alumina column to purify this stuff, eluted
with hexane.
Also why BHT is even a problem? It should not interfere with most reactions. |
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d******s
发帖数: 674 | 38 DIONEX AS12A? Or CS12A?
Was your method gradient elution? Check your gradient delay volume. |
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c******m
发帖数: 884 | 39 are you using the same type of ACN? or from the same vendor? some type of
organic solvent has stronger UV absorbance.
another reason is some thing is stuck on your column and can only be eluted
out by ACN. |
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b*****y
发帖数: 175 | 41 My protein was eluted in 0.3% vitamin C in H2O and lyophilized (vitamin C
was intended to prevent any Met oxidation of my protein). Since I know
highly acidic pH is not good for LC-MS so I tried three different approaches:
1. directly dissolve in ammonium bicarbonate and adjust pH to 8
2. directly dissolve in ammonium bicarbonate and dialyzed against ammonium
bicarbonate (3 changes in 6 hrs) and the final pH is 8
3. dissolve in ammonium bicarbonate and buffer exchanged to 3M guanidinium
hydrochl... 阅读全帖 |
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b*****y
发帖数: 175 | 42 Thanks a lot for all your responses.
I did just inject the sample directly (highly acidic) and I did not have a
good spectra at all. The reason I am doing basic pH was based on our
previous experience and the recommended column conditions. Also I always
perform intact protein analysis and tryptic digestion peptide analysis
together. Trypsin works best at pH7-8 so I always try to use ammonium
bicarbonate to achieve this pH and have minimum salt after lyophilization.
I highly suspect vitamin C con... 阅读全帖 |
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v******0
发帖数: 265 | 43 Ok, but the peaks I got from bare silica on small molecules are also ugly.
But the molecules I tested until now are something people use 80%ACN as
isocratic to elute, such as uracil, cytosine, etc.
Is that because these are not retained well with my column, so I don't have
good peaks. If I goes for some other more hydrophilic small molecules, could
it be better?
The other question is since Silanol makes the peptide peak tailing, if I use
UV as detector, which doesn't require acid, could the resu... 阅读全帖 |
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f*****n
发帖数: 970 | 44 h2s is polar
and cs2 is non-polar
and molecular weights are different |
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h*****t
发帖数: 1226 | 47 1M NaOH的pH应该是14.
还有Tris buffer在低于pH6.5的时候Buffer capacity很小了. |
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k******e
发帖数: 8870 | 48 换强一点浓度高一点的BUFFER先洗洗再换成你要的BUFFER |
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a*********f
发帖数: 33 | 49 If the identities of each LC peak are known and no co-elution,and the target
compound has UV absorbance, LC-UV is the most reliable way for quantitation
.Otherwise, try LC-MS or LC-SRM-MS, which should work for most of compounds. |
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g******e
发帖数: 20 | 50 2. “Dried blood spots as a sampling technique for the quantitative
determination of guanfacine in clinical study,” Bioanalysis, 2011, 3, 2501-
2514.
3. “Semi-automated direct elution of dried blood spots for the
quantitative determination of guanfacine in human blood” Bioanalysis, 2012,
4, 1445-1456.
我自己的文章，发现自己竟然没存一份。
先忱心谢过拉！我的email: y**********[email protected] |
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