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a****o
发帖数: 1786 | 2 MgCl2
DTT
sometimes make big difference |
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x*******o
发帖数: 2581 | 3 EB也叫有毒？那生化试剂就都有毒了。DTT强还原剂，大家不照样用？ |
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j******9
发帖数: 180 | 4 polyaerylamide DMSO SDS DEPC 二乙基焦碳酸酯 DTT TEMED 氯仿 Triton X
-100 等都用 只有DNA荧光染料类的东西让我有感觉 |
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l*******k
发帖数: 361 | 5 先透析，去掉imidazole， glycerol 5-10%, protease inhibitor不是必须的，可以加
一点EDTA, 1mM, 绝大部分serine protease没有Mg离子都没有活性了，有的蛋白要加DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
然后分装，用液氮进行迅速冷却，然后保存在-80, 有些比较脆弱的蛋白即使这样保存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白
推荐你去读一下一个科大师兄写的从纯化到星辰，里面提到了很多蛋白提纯跟保存的技
术，对于做蛋白的很有帮助 |
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a****k
发帖数: 1130 | 6 偶来补充自己的看法吧：透析不是必须的，只要imidazole不影响activity就好。一般
不用再加protease inhibitor，因为细胞裂解的时候不是已经加过了吗。不建议加EDTA
，不知道lz是要做什么activity assay，很有可能这个蛋白本身自己就是需要镁离子的。
glycerol，对于一般的蛋白我们都是加10%，然后分装后用液氮冻完存在－80度。但是
碰到很不好保存的蛋白，比如冻了一两个月就没有activity的，把glycerol加到20％会
有帮助。
DTT或者beta mecapitalmethanol,保持溶液的还原状态，视情况而定。
存也会失活，那就需要找到合适的buffer，或者每次都用fresh made的蛋白 |
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r*********y
发帖数: 124 | 7 我做M2 FLAG IP后的蛋白在0.5mg/ml 3XFLAG 室温1小时可以很好的 洗下来（4ml 洗脱
体积)。在跑胶之前需要除去过量的3XFLAG,同时把体积浓缩到100-150ul。我先用GE
G25 gel filtration column除去3XFLAG, 然后用vivan spin 6浓缩，发现还有很多
3FLAG在样品里。
另外我的样品在浓缩之后很粘，上样的体积加大后胶就跑的很慢还smeared（我的bait
蛋白最多200ng)。所有纯化，浓缩都用同样的buffer, 20mMTris pH7.5, 150NaCL, 10%
Glycerol, 1%NP-40, 1mM DTT, 1mM EDTA.我想请教高手;
(1) 如何除去多余的3FLAG
(2)如何避免浓缩是样品过粘影响跑胶。
谢谢 |
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b******n
发帖数: 4225 | 8 取决于你的目的啦
Talon基于cobalt跟his tag结合，
优点是不太容易被lysate里面的巯基乙醇，DTT等还原
跟E.coli内源的含his的蛋白(如SlyD)结合力弱，纯化效果好
缺点嘛，就是有时候跟目的蛋白都不能结合
Ni-NTA的缺点差不多跟Talon反过来吧
NI-NTA 和 Talon mental beads 相比， 纯化的效果那个好些？
谢谢！ |
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V***b
发帖数: 3419 | 9 tunicamycin, DTT, castanospermine, geldanamycin, thapsigargin |
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c******y
发帖数: 148 | 10 我们做的是bluenative page， 1st dimension跑完之后，用1*SDS loading buffer
loading dye> with 100mM DTT 室温浸泡1h，之后按照正常western blot处理 |
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K**********e
发帖数: 188 | 11 前两天有人问过，但是没人回答。我也有这个问题。
跟蛋白有关的buffer里面的盐，多数时候是NaCl，但是nuclear extract经常用KCl，这是为什么呢？
也常常加1mM 的Mg，不过Mg不是protease需要的吗，会不会导致蛋白降解？
更疑惑的是还有同时加Mg和EDTA的，EDTA不是chelate二价离子吗，这样的话不是互相取消了吗。EDTA的目的是什么
呢？
有时候加1mM DTT在buffer里面，有时候又加beta 巯基乙醇。这有什么区别呢？
盼回答。谢谢。 |
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a****o
发帖数: 1786 | 12 Did you use agarose or polyacrylamide gel?
Try to add some BSA and tRNA as nonspecific competitors.
Does your protein tend to form oligomer?
You can also try to add some DTT. |
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w******e
发帖数: 1187 | 13 前段时间来求救，做EMSA，连作为negative control的library都bind的一塌糊涂：
http://www.mitbbs.com/article0/Biology/31394721_0.html
得到了大家的很多宝贵建议。综合考虑后觉得自己的protein是形成了aggregate，拖了
n久总算确认
了——见附件图。gel 是4% native PAGE，silver stain，lane 1/2/4是target
protein，
3/5是control（5是homolog，如果没aggregate的话target也该在那个position）。其
中lane
2/4加了0.1%/1%的triton，没区别。另外也试了DTT，也不行。真衰呀。。。
这个target是我side project必须要用的，而且要用大量。好不容易找到家便宜的，还
这么背。。
。还有什么方法可以搞掉这个aggregate吗？更狠的detergent？？请指教！//bow |
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T**********t
发帖数: 1604 | 14 3/5都是什么control啊？你说5是homolog，是你的target protein的homolog么？即使
是近似的蛋白，也不一定在native gel上跑得一样的。还有就是你用DTT处理浓度用了
多少，处理了多长时间？ |
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w******e
发帖数: 1187 | 15 3是BSA，5是target的homolog——你说的没错未必跑的完全一样。他们MW和PI都
还接近，我就是要show个类似的protein能成band能migrate其实呵呵。
DTT我只做了一次，加了1mM。不知道还要incubate一阵，土了。。。不过整个
准备过程下来，到把probe加到protein里也已经算处理了近1h吧。然后probe
protein interaction也要1hr+ |
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T**********t
发帖数: 1604 | 16 如果你的蛋白已经aggregate了，加1mM的DTT还原能力不够的。1mM的话，一般只能起防
止二硫键生成的效果。用来打开已经形成的二硫键的话，你加到5mM甚至10mM再试试，
incubate个半小时到一小时的样子再跑胶。
另外，你的蛋白跑SDS胶是纯的么？
还有就是你的蛋白上样量明显太多了，少加一点。
还还有，上回你问的那个Reverse transcription的efficiency的问题，我帮你问过了
，他们都不做测试的，估计反正library够大。。。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 17 从理论上来说，表面的二硫键应该可以被打开，但如果你的蛋白形成了complex，那内
部的还是很难被打开。 |
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h*****t
发帖数: 1226 | 19 redcuing gel? if so, you will not see dimer, maybe it is just a contaminant |
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v***a
发帖数: 1242 | 20 大约于？是约大于的typo吗？
有时也可能是不同组织细胞中蛋白会有不同的modification，或者isoform，分子量就
会有上下浮动的。 |
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O******e
发帖数: 4845 | 21 You are right. But I'm more comfortable of using native gels to study
oligomers. |
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p****y
发帖数: 23737 | 22 【 以下文字转载自 Vegetarianism 俱乐部 】
发信人: purity (purity), 信区: Vegetarianism
标 题: 誰是孟山都(Monsanto) ?─ 印度篇 I (by Ideolotopia)
发信站: BBS 未名空间站 (Sun Sep 19 15:37:39 2010, 美东)
http://www.wretch.cc/blog/cliquer/17797306
http://www.youtube.com/watch?v=P_RhMe4iN8o
[在2009年3月8號世界女性節這一天，僅以此文獻給女性，如生態女性主義者希瓦
Vandana Shiva [Vandana_Shiva 連結] 以及法國記者Marie-Monique Robin[連結]：沒
有她們，生命不僅貧乏，而且缺乏正義。]
擁有17,500員工，遍及46個國家，孟山都(Monsanto, [官網]) 是基因改造產業(GMO, [
連結])的領導者，全世界80%的基改作物都屬於它。同時也是工業史上最具爭議的公司
之一。
據2007年統計，孟山都(Monsanto)在世界上... 阅读全帖 |
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o*****n
发帖数: 445 | 23 现在在e coli里表达一个蛋白，这个蛋白序列里有cystein。我想知道蛋白纯化时需不
需要加入dtt.
蛋白是neuron dendrites里的一个蛋白,不知道dendrite里是不是reducing
environment?
谢谢。 |
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o**i
发帖数: 1165 | 24 纯化蛋白一般都加DTT吧
防止非特异cys bonding? |
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o*****n
发帖数: 445 | 25 如果都加dtt,需要形成双硫键的蛋白就不能正常fold了？ |
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y*********o
发帖数: 38 | 26 IgG 在用DTT 还原后并烷基化，发生蛋白聚集，怎么办。请高手解答。 |
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b**y
发帖数: 86 | 27 最近刚开始做EMSA，我用的是Pierce的Lightshift kit. 多次实验都只看到
nonspecifec binding（不能被unlabeled oligo竞争掉）。我发现一个原因可能是
binding reaction里盐浓度过高，因为kit提供的binding buffer（10*）含有500mM
KCl,而我的nuclear extract最后是由high salt buffer提取的，F.C.225mM NaCl。于
是我省略了binding buffer，把最后的NaCl浓度调整在50-75mM，得到了一条specific
的binding，但是非常弱。
问题1. 我看到的paper和protocol都使有类似的binding buffer，而且也用类似方法提
取核蛋白，好像并不考虑nuclear extract里的盐浓度，事实上这个浓度很高。但是，
我的几个sample extract蛋白浓度不同，加入同样多的蛋白的话最终盐浓度就会不同。
大家怎么解决这个问题？透析又怕蛋白容易降解。
问题2. 我加入的nuclear extract的体积无法忽略，大概有10u... 阅读全帖 |
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I*****y
发帖数: 6402 | 28 what sizing column did you use? I guess your proteins of interest have
aggregated without salt or DTT? The aggregated proteins behave like a huge proteins
that you find in the first few fractions.
glycerol |
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s******y
发帖数: 28562 | 29 有几个地方补充一下
2.如果蛋白不纯，比如很多杂带，你怎么确定你要的蛋白在里面？用什么方法？
把符合尺寸的带切下来，送去做质谱
3. 怎么测试蛋白的热稳定性？用什么biopgysics的方法？
一大堆经典方法。自己去查
4. 用质谱测MW，有时有偏离，那么表达后修饰都有那些需要考虑进去？
（不考虑糖基化）
表达后修饰可以直接用质谱来测。只要你告诉对方你有这个需要，他们就会
给你做
5. 怎么确定蛋白是否有糖基化修饰？
质谱是最直接的方法。
6. 蛋白浓缩的时候有沉淀，一般你会怎么办？
严格控制条件，一定要加够DTT. 然后把透析的烧杯密封起来
透析完之后，用高速离心把沉淀成分去掉 |
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b******3
发帖数: 377 | 30 否则简单的PBS里面也不知道加不加protease inhibitor，DTT，glycerol等。谢谢！ |
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f*****s
发帖数: 104 | 31 最近用GE healthcare的glutathione sepharose 4B resin purify a couple of GST-
tagged transcription factor DNA binding domains. The protein were bound to
the beads with high efficiency. However, when I used glutathione buffer to
elute the GST-protein off the beads, they can't be eluted. I tried 10 mM ,50
mM and 100 mM glutathione. To make the buffer, I diluted 1 M Tris (pH 7.5
at room temperature) to 50 mM, and added glutathione powder. There was also
2 mM DTT in the buffer. The elution was carried out... 阅读全帖 |
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w********r
发帖数: 1431 | 32 1.wash cell twice with PBS
2. incubate with DSP/DMSO/PBS solution for 20min at RT (freshly!!! prepared
DSP,2.5mg DSP-->480ul DMSO-->12ml PBS, final 200ug/ml DSP)
3. wash 2XPBS
4.incubate 5min with 50mM Glycine/PBS
5. wash with PBS
6. harvest cell in RIPA buffer with PIM, w/o DTT!!!， followed by CO-IP. Wash stringently with RIPA before WB.
Good luck! |
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l**n
发帖数: 109 | 33 膜蛋白SDS-PAGE样品不要煮，否则会聚集，另外要多加SDS和DTT/BME |
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V***b
发帖数: 3419 | 34 SDS sample bufffer boiling, with no DTT or b-ME. |
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x***o
发帖数: 47 | 35 我的一个蛋白有4个cys，下了ni柱就加了dtt，过分子筛时大部分在外水体积出来，在
单体位置
也有一点，但是不纯，外水体积出的一浓缩就沉淀，单体位置的没事，请问各位大侠有
什么好
办法消除多聚吗，还有沉淀是什么原因，谢谢 |
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g*********r
发帖数: 9366 | 36 Ni-column buffer 加BME， 管里加DTT，不可能交联 |
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e****s
发帖数: 1125 | 37 多聚也不完全就是disulfide bond. 你要是加了足够的DTT，就算Ni-column组分形成2
硫健，应该
也能打开。
可以试试看变化盐浓度，不知道你现在盐浓度多少。看看提高盐浓度有没有改变多聚和
单聚体间的比
例。另外，有时候盐浓度也能提高浓缩过程的的稳定性，大部分蛋白在100-500mM NaCl
比较稳定。还
有就是浓缩方法也很重要。 |
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s*********t
发帖数: 600 | 38 对啊，他们美国童鞋还加盐和辣椒油，太土了。
我一般都是加10×的PCR buffer的。个别美国童鞋也加，但是加的都是不带Mg离子的，
缺少了那种独
特的苦涩。有时候我为了飘香还加上少许DTT，当然如果加氨水就味道更浓了，更好喝
了。
师兄爱喝加神马的咖啡呢？ |
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s******y
发帖数: 220 | 39 不小心被扎了，扎的不深，但是出血了。
针里是小鼠组织放在buffer里面，组织已经被homogenize过了
那个buffer里面都是好东西，dtt, sds,还有proteinase inhibitor，
我用dd water冲了，然后又用酒精冲了， 把血挤出来了一点，然后用bandage包了。
不会有问题吧，要去医院吗？
已经半个小时了，不会明早起来，手就没法用了吧？
好害怕啊.
求救！！！！ |
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b******e
发帖数: 3348 | 40 我只做过cell culture,对mouse model一窍不通，
做肿瘤westernblot的话是不是可以可以和细胞一样直接在sds-dtt buffer里
homogenize sample,煮沸 然后run, |
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i*****g
发帖数: 11893 | 41 用DTT还原
SDS浓度提高些，外加什么 胆固醇类变性剂
变性后再blot transfer
就这些招数了 |
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i*****g
发帖数: 11893 | 42 用DTT还原
SDS浓度提高些，外加什么 胆固醇类变性剂
变性后再blot transfer
就这些招数了 |
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f*c
发帖数: 2726 | 43 做MS也没问题啊。就是可能loading buffer最好不要加DTT，用beta mercaptoethanol |
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r**a
发帖数: 121 | 44 最近在做组织的FACS，用Trypsin和collagenase处理
我用的是10X Trypsin EDTA，后来发现EDTA是Trypsin和collagenase的抑制剂
Trypsin Inhibitors:
* Pancreatic-, soybean-, lima bean-, and egg white- trypsin inhibitors (
see section on Trypsin Inhibitors)
* DFP
* Aprotinin
* Ag+
* Benzamidine
* EDTA
Collagenase Inhibitors:
* EDTA, EGTA
* Cysteine, histidine
* DTT
* 2-mercaptoethanol
* o-phenanthroline
* Hg2+, Pb2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+
* Not inhibited by DFP or serum
(White and White ... 阅读全帖 |
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M*******C
发帖数: 183 | 45 我看了一下网站，兼容的试剂名单里没有SDS，你用它来做SDS的样品好用吗？
你说的蛋白沉淀下来再测是什么意思？就是裂解-离心-取上清？
比如我的细胞，我加了含SDS的去裂解，为了核蛋白，这样lysate很粘，我就去超声，
等离心后经常看不见沉淀，直接就拿去用了。
The RC DC protein assay is compatible with the following reagents and
buffers in addition to those compatible with the DC protein assay:
CHAPS 2% ReadyPrep sequential extraction reagents 2 and 3
DTT, 350 mM Sodium hydroxide, 2.5 M
EDTA, 0.1 M TBP, 2 mM
Imidazole, 0.5 M Tris, pH 8.4, 0.5 M
Laemmli buffer with 5% β-mercaptoethanol ... 阅读全帖 |
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b******y
发帖数: 627 | 46 should be minimal. assume zero if you just use it for reducing agent for
protein purification. it is a different story if you are using it for redox
potential determination since it requires accuracy. |
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b******y
发帖数: 627 | 48 蛋白质聚沉实验 = CoIP?
Thanks. |
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c********b
发帖数: 363 | 50 楼上的思路不错。
其实方法很多，但是比较简单的还是先crosslink，然后再用 harsh buffer把核裂开，
然后复性，最后该干嘛干嘛。
这里有一篇你可以参考：Rapid and phosphoinositol-dependent binding of the SWI
/SNF-like BAF complex to chromatin after T lymphocyte receptor signaling
我自己用的protocol是这样的：
如果只是检测蛋白表达:
用High SDS buffer:
15 mM Tris pH 8.8, 5% SDS
0.3 M DTT, 15% Glycerol
我的是植物细胞,一般是liquid nitrogen grind之后加buffer,boil.如果是cell line,
collect细胞之后加上buffer 然后直接煮.除非是非常不稳定的蛋白,不然连protease
inhibitor都可以不加.
看到蛋白之后如果是做IP:
先crosslonk(用什么chemical得自己琢磨),然后把ripa的SDS含量加到1% ,... 阅读全帖 |
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