m***e
发帖数: 21 | 1 我觉得有一下几个原因不用E。COLI
1。 一般的E。COLI细菌用的CODON PREFERENCE可能与MAMALIAN CELL不同，所以你用普通
的BL21的话可能蛋白根本不表达，但是这点可以克服，你可以用那种加入了RARE CODON的
CELL LINE，比如ROSETTA GEMI系列。
2。有一些MAMALIAN PROTEIN是需要表达后修饰才有活性的，而E。COLI可能无法提供这种
环境。
3。但是也有很多人用E。COLI表达真和生物蛋白，有时也能成功，但YEAST其实是一种挺
好的表达环境，比在FLY，或者作细胞培养方便多了。
所以建议你试一下用E。COLI，不行的话想办法提高YEAST中的产量。至少我知道不同培养
液对E。COLI表达量影响很大，可能你也可以换其他培养夜养YEAST。 |
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w********2
发帖数: 632 | 2 e coli生命20分钟
一天72代
一年30000代
1940年代研究开始到现在80年，相当于跨度2百万代。
假设e coli和人genome一摸一样，人寿命100年一代，跨度2百万代相当于2亿年。
也就是说分子进化论用e coli做模型的所有理论只有100年2百万代 e coli历史，相当
于2亿年人类历史。
超出此范围的极小概率突变捕捉不到的。但极小概率突变右可能是关键影响。 |
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W**********r
发帖数: 8927 | 3 Cheese sold at Costco linked with E. coli outbreak in five U.S. states
An E. coli outbreak in several U.S. states may be traced to cheese sold at
Costco stores, CNN reported on Friday.
The Bravo Farms Dutch Style Raw Milk Gouda Cheese was offered for sale and
in-store tasting at Costco stores in Arizona, California, Colorado, New
Mexico and Nevada between Oct. 5 and Nov. 8, according to the report.
At least 25 people were sickened in the outbreak, the report said.
Consumers with the cheese (Cost... 阅读全帖 |
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x***u
发帖数: 297 | 4 你说的是2014年9月26号和十月2号的的检测发现e coli的报道吧？
我查了一下报道，所有的都可以追溯到三个原始报道：2014/9/26
第一次在g供水系统里发现e coli(61个样本中有5个检出), 复查发现
四例。市政府建议boil water 。10/2又发现一个样本有e coli 。期
间与之后的测试inconlusive. 详见2016年的调查报告：
https://www.pnws-awwa.org/uploads/PDFs/conferences/2016/Technical Sessions/
Friday/McDaniel Mercer Island Response.pdf
然后10/6有一例疑似儿童病例，没有确认和饮水有关联。
关于大量儿童因e coli 生病的报道是另外一起吗？
还有I－90 收费是从哪传来的？有报道吗？谢谢。
我觉的住在岛上还是很方便。感觉到factoria比从somerset 山顶
上下来还要快一些 :-)。最大的缺点是要和土豪做邻居。 |
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l**********1
发帖数: 5204 | 5 是啊 违反 以下的游戏理论 控制 的可能性 很大阿
2002 Nature paper E coli 多样性 石头 剪刀 布 的 游戏理论 控制
E coli 扩散表面积 和 E coli的多样性成反比
//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12110887
then just one question:
你那种省事的两个一起敲除 和 E coli 扩散表面积 操作 哪一种 对biodiversity 的影响更大啊?
might be a idea for later proposal. |
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l*********r
发帖数: 695 | 6 e.coli生命只有20分钟，那一天72代的数量后代数量是，4x10^21个个体。e.coli的质
量是9.5x10^-9g. 所以，72代后数量是4x10^13g, 4x10^10kg, 4*10^7吨， 4千万吨?
你肚子里的一个大肠杆菌有长这么快吗？
你说的e.coli只在营养丰富的培养基中，在对数生长期会长这么快，平时它哪有不停繁
殖？一毫升里有10^9个细菌，就不会长了。如果要你说的后代达到4x10^21个个体，那
培养基的体积会达到4x10^12毫升，也就是4x10^9升，也就是4x10^6立方米，也就是4百
万立方米的培养基，也就是一个边长160米的立方体。 |
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X*******0
发帖数: 134 | 7 决定能否用Lmbda噬菌体转染的因素是什么?
我要筛文库,但是普通常用的E.coli本身带这个基因所以没法筛,需要把文库弄到一个营
养缺陷型的E.coli株里.
缺陷型株是E.coli BW16787 genotype:
F-, Δ(argF-lac)169, ΔphoA532, λ-, rpoS396(Am), rph-1, Δ(phnP-phnH)523(
Tn5-1/132), hsdR514, creC510, Mu+
这样的菌能用Lambda噬菌体包装的大容量载体去transfect吗? |
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h**********r
发帖数: 671 | 8 长假刚回来。我承认我逻辑更加混乱了。一直有这么个问题纠结：基因表达成蛋白质时
，需要细胞生长吗？比如说E. coli，细胞生长仅仅是稀释作用吗？最简单的IPTG诱导
时，IPTG加得过晚，整个表达量也不会高。那么这个受IPTG诱导的蛋白质的表达，主要
在新分裂的细胞中吗？E. coli的单个细胞也有从小长到大的过程吧？E. coli是不是也
有个“可遗传的诱导状态”？
也许有很多模型解释了，我也没有查。大家能发表点看法吗？多谢！ |
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l****e
发帖数: 157 | 9 问个土问题：实验室的-80C冰箱只有底下一层有空，已经放了E.coli competent cells
（在试剂盒里）和一些准备裂解的E coli cell pallets （在离心管里）。现在需要冻
mammalian cell lines，已经把cryo tubes封在styrofoam rack里，准备放在-80C冰箱
，过几天再转到液氮罐。然后有个学生问说和E coli放在冰箱的同一层会不会被污染？
我自己觉得是个低概率的事情，因为各自都在封闭的管子里。但我也不是很肯定，想问
问大家这种情况会不会有顾虑？谢谢先。 |
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w********2
发帖数: 632 | 10 猴子到人只要2万代的时间，但 e coli在人密切观察下进化了200万代，还没有实现种
间突变，没见e coli 到 yeast。数据说话吧。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 11 Sorry I couldn't type in Chinese with lab computers.
I am trying to express my protein in E.coli these days. I tried with my
construct in E.coli BL21(DE3) with 1mM
IPTG at 37C for several time points, but couldn't observe any induction.
Does this mean there is no need for
me to try any lower temperature, such as 30C, 25C,etc, since even 37C has
no induction and they all won't
have any induction as well?
Thanks! |
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H*g
发帖数: 2333 | 12 Thank you, guys!
I sequenced my expression plasmid and I am sure it is correct, no frame
shift, no mutations. I feel my protein
is not toxic to E.coli. I shaked the E.coli culture at 37C till OD600=0.6,
then add IPTG to 1mM. I also had a
second culture but not add IPTG.
I took 1.5mL every hour for 7 hours from both cultures (with and without IPTG), spin
down, sonicated, and loaded side-
by-side on SDS-PAGE, I couldn't see any band being induced.
I would try lower temperature and lower concentrat... 阅读全帖 |
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B***v
发帖数: 113 | 13 Transformation的时候，一个E.coli只能吃掉一个质粒吗？原理是什么？
我如果transfrom一个质粒library，一个E.coli会不会吞掉>=2个质粒？打算做个
screen |
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B***v
发帖数: 113 | 14 Transformation的时候，一个E.coli只能吃掉一个质粒吗？原理是什么？
我如果transfrom一个质粒library，一个E.coli会不会吞掉>=2个质粒？打算做个
screen |
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w********2
发帖数: 632 | 16 e coli基本是最快繁衍的模型了，所以人类对分子进化的所有理论都不超过这个
limitation. |
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w********2
发帖数: 632 | 17 e coli如何进化成人类实在是想不通，1个染色体没有到23对不同染色体，4mb到1亿b
，20分钟到100岁，噻。进化论专家是想象力最丰富的艺术家。 |
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w********2
发帖数: 632 | 18 对啊，e coli的祖先很简单，怎么能够进化成人呢？
染色体是怎么进化出来的？为啥要染色体啊？好像只有eukaryotic cells 才有。
线粒体来源于细胞好像是一种hypothesis，不是科学事实。 |
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M*P
发帖数: 6456 | 19 研究进化本来就逼用没有
：e coli生命20分钟
：一天72代 |
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T*********s
发帖数: 20444 | 20 e coli 两亿年了怎么还没进化成人类？？？ |
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w********2
发帖数: 632 | 21 reductionism 和 constructivism的区别是方法学的问题，比如in vitro的cell
study发现的东西到in vivo的生理就变了。
现在我们就在谈e coli本身，在人眼前发展了2百万代，也好像没变出个yeast种来，更
别谈小动物。
那么猴子到人现在是说花了100万年，其实也就1-5万代，是不是太快了？
pdf |
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a***e
发帖数: 27968 | 22 靠，进化快的，下一代和这一代在你看来就是完全俩物种了
你真想看e coli进化你得给它进化压力
在它生存方式的那个环境，丫是优化的，1百个million出个奇葩你能检查得到？这个奇
葩很容易就在资源竞争中输了消灭了
★ 发自iPhone App: ChinaWeb 1.1.4 |
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c****e
发帖数: 1567 | 23 这个岛肯定有问题，记得前两年的 e coli 危机整个大西雅图地区只有这个岛有问题，
光饮用水就引发很多小孩子生病，据说这个危机很有可能重演，说这个岛易居也就能忽
悠新来的，特别是对老中来说
还有交通和生活不方便，岛上什么都选择太少，干点什么都要出岛，麻烦，还有90很有
可能要收费 |
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a****e
发帖数: 606 | 24 If you cook them, it's no problem
E. coli are easily killed by high termperature. |
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R*s
发帖数: 2041 | 25 1. never heard of measuring bacterial at OD546 and calculating as u
said below. We only do it at OD600.
2. What temperature you grow the cells? Hope it is 37, not 30.
BL21(DE3)Plyss does grow relatively slower than other E.Coli strains.
However, it is not as slow as yours.
3. In fact, 12 hours for your transformed culture to reach OD 0.8 is not
terribly slow. It usually take us 6-9 hours to do so.
4. Last suggestion, make sure your Amp and Chl concentration is correct.
Even if they are correct, |
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f*********p
发帖数: 13 | 26 IPTG induces the expression of T7 polymerase (T7 pol is under the control of
lac, inducible by IPTG), which in turn translates your gene of interest
because it is under the control of T7 promoter and has to be processed by T7
pol, but not E.coli pol. without IPTG, T7 pol has very low basal expression
level, and your gene of interest will have some low basal expression too.
plysS expresses a low level of lysozyme, which functions as an inhibitor for
T7 pol, and thus, with no IPTG induction, inhib |
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f*********p
发帖数: 13 | 27 I do not think you fully understood my answer to your question yet. let me put
it this way.
what kind of BL21 are you using? BL21 has BL21 (DE3), (DE3) pLysS, ...
different subtypes. I assume that you are using DE3 related strains. DE3
strain has a lambda phage lysogenized in BL21 e.coli, on which there is a T7
polymerase gene under the control of lac promoter. when you grow the cells up,
no or very little T7 pol can be expressed. when you add IPTG, it induces the
expression of T7 pol, which the |
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w*****r
发帖数: 239 | 28 stir well, dip the tip fully in the cell suspend, use medium output,
a little foam is ok, don't be too nervous. I have done it hundreds of
times, protein is much tougher than you thing.
if there is no activity, it means there is not, not because of
the sonication. By the way, e coli is not that tough, don't sonicate too
long, and keep all your stuff in ice during the whole procedure. As of my
experience, heating is a bigger problem than foam. |
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D****s
发帖数: 5 | 29 此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？ |
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s********n
发帖数: 2939 | 30 要做一些E. coli的KO和KI，据我所知有好些方法，有没有一些比较常用有效的，最好
是不需要marker的。
Thanks a lot! |
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i******g
发帖数: 90 | 31 Does anyone know where to buy E. coli gene library (all 4000 genes are
higtagged)? thanks. |
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h****6
发帖数: 229 | 32 What is the purpose of having all E.coli genes expressed? |
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x********u
发帖数: 430 | 33 This is a science paper. But I don't think the approach they adoopted for
engineering the E. coli metabolic pathway is novel, in fact, rather
traditional. How could they make it to Science? Just optimization of copy
number and promoter strength, then they get a science paper. Does the world
change? |
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f****n
发帖数: 67 | 34 【 以下文字转载自 Chemistry 讨论区 】
发信人: funren (funren), 信区: Chemistry
标 题: 有没有人测过E COLI中TMAO reductase的活性测定啊，求助
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 16 16:42:01 2010, 美东)
看了一些文章，方法都市引用1980年前的文章， 也没有介绍原理的，Google也找不到
，我按照一些文
章的方法用benzyl viologen和tmao做，就是做不出活性，也不知道哪里有问题， 有没
有人又详细
的方法和protocol的，谢谢了， |
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T**********t
发帖数: 1604 | 35 I would try again with lower IPTG conc. (say, 0.4mM) and lower temperature (
say, 33C).
Also, if your protein is toxic to E.coli cells, it helps if you use the
strain BL21(DE3)pLysS. |
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p********o
发帖数: 29 | 36 先把所有的密码子换成E.coli的偏好密码子，重新合成基因片段
把IPTG从0.05mM起做浓度梯度，应该没有问题，我也有类似的经历后来就这样解决了 |
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H*g
发帖数: 2333 | 37 Do you mean whole lysate by just adding loading buffer (let's say 50uL to
precipitated E.coli from 1mL culture), boiling for 5min, and loading 15uL to
each lane on SDS-PAGE? |
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s*********f
发帖数: 155 | 38 also make sure your IPTG is good, e.g., freshly made solution, not a
solution that has been frozen and thawed multiple times, and known to induce
protein expression for other plasmids in e.coli. |
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s*********f
发帖数: 155 | 39 also make sure your IPTG is good, e.g., freshly made solution, not a
solution that has been frozen and thawed multiple times, and known to induce
protein expression for other plasmids in e.coli. |
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s*********f
发帖数: 155 | 40 also make sure your IPTG is good, e.g., freshly made solution, not a
solution that has been frozen and thawed multiple times, and known to induce
protein expression for other plasmids in e.coli. |
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e****s
发帖数: 1125 | 41 难道现在回帖都要高喊一声Sunny?! hehe
不知道别的地方，我们实验室做Expression test的标准程序是lysate和Sup都要检测，
用WB。特别要是用E.coli来表达真核蛋白，很难在考染里看到Overexpress的条带。
建议直接做WB，其实是省时间的。
buffer, |
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g*****n
发帖数: 241 | 42 我在E. coli里面表达两种不同的receptor tyrosine kinase的kinase domain，结果一
个有tyrosine kinase activity，一个没有。请问这种情况常见吗？该怎么优化才能使
得它有kinase activity啊？
谢谢！ |
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s*******e
发帖数: 57 | 43 不是学细菌的，很好奇，请专家高手讲讲这次德国的E. Coli outbreak:
1, 为什么细菌从蔬菜进入人体后，人会死，难道抗生素抵挡不了；
2，为什么分析检测这么难，需要这么天，德国到现在还没有找到；
3，请高手讲讲生物实验室如何进行这个分析检测过程，以及如何治疗消灭；
谢谢。 |
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j****x
发帖数: 1704 | 44 1. 没有临床证据表明抗生素对EHEC有效（抗性？），同时可能诱发肾衰竭（toxin）。
目前主要的治疗手段还是血透析，然后等待病人自愈。
2. 检测并不难，难在溯源，不仅仅是个生物医学问题，还是政治经济问题。
3. 类似E.coli O157,这次也就是个new stain而以。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 46 coccus (复数 coli) 杆菌。可作词根。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 47 不是说这个E. coli有很多抗性基因么？不过好像医生都不建议使用抗生素，据说是防
止杀死细菌的同时释放出更多的toxin。 |
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B****i
发帖数: 107 | 48 分子量好像大几K，
是一个膜蛋白， 比较容易糖基化， 但在E Coli系统里面应该不太可能
谢谢 |
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s********n
发帖数: 2939 | 49 E. coli也有glycosylation的，尤其是一些膜蛋白。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 50 没有买现成的E.coli的lysis buffer.网上看了看，多种多样的。大家给个自己用的比
较好的recipe吧。裂解完之后测酶活的。多谢了！
包子伺候。 |
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