s********r
发帖数: 312 | 1 我是biorad的那个loading buffer,950ul+50ul beta-ME,然后用水1:1稀释。直接加到
孔里，一般12孔板一个孔100-250ul，晃一晃等2分钟，然后200ul的tip前面剪掉，刮一
刮收起来，煮沸上样。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 2 就是做protein电泳的那个buffer。
现在用的配方是网上找来的，但是发现上样的时候protein sample不下沉，而买来的
marker明显就load下去了。用量很大，老板不愿意买。。。。
谢谢！ |
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j*****a
发帖数: 92 | 4 阴离子交换色谱 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences)pH
stability Working Range 2-12 .用1 M NaOH 洗,用纯水洗到pH 7, 换TrisHCl
buffer pH 5.5 平衡, elute pH 变成9.洗了一天还是pH 9. 有人遇到过吗？ |
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j*****a
发帖数: 92 | 5 Good point. I need to switch buffer system. |
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w*******r
发帖数: 23 | 6 RT.
请问 IP 和 co-IP 的lysis buffer 可以通用吗？
这两个在实验操作过程中具体有什么区别呢？
谢谢。 |
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x*****e
发帖数: 309 | 8 应该可以，你可以查查buffer成分，其实差不多. |
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t****y
发帖数: 168 | 9 能。
理论上，只要是相同的名字，就应该是同一种蛋白。相同的蛋白在特定的条件下应该有
相同的反应效率。
实践上，曾经无论什么公司的酶都用NEB的buffer,没有不工作的。 |
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n****0
发帖数: 696 | 10 谢谢。不过他们buffer的成分都有点小差别，可能影响也不大，我试试看 |
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s*******m
发帖数: 24 | 11 One minute Striping buffer from gmbiosciences. Works nice and fast for most
antibodies. |
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d****i
发帖数: 2346 | 12 对fluorescent二抗的strip buffer哪个好些？ |
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s*******m
发帖数: 24 | 13 One minute Striping buffer from gmbiosciences. Works nice and fast for most
antibodies. |
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d****i
发帖数: 2346 | 14 对fluorescent二抗的strip buffer哪个好些？ |
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x*****o
发帖数: 441 | 15 很多buffer里面都有EDTA, 它的作用是什么?如果不加会怎么样? |
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w********a
发帖数: 324 | 16 Qiagen kit 经常是column用完了，但是还剩很多buffer。
Miniprep kit 的column是可以单独定的。但是PCR clean-up或者Gel extraction kit
的column不能单独定。不知道大家是怎么处理的？有其他公司的column可以作为替代品
吗？
多谢！ |
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s******s
发帖数: 13035 | 17 扔掉。
buffer不值钱，值钱的是column。
kit |
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s******y
发帖数: 17729 | 18 直接扔掉
虽然可以和其他公司的混用，不管是PCR clean-up还是胶回收的，基本上所有的公司的
都是buffer有多柱子不够
kit |
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G*******a
发帖数: 414 | 19 buffer是Qiagen额外送给你多的，剩下直接扔掉就可以了。 |
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w********a
发帖数: 324 | 20 ok. 非常感谢！
我说的就是这个意思。单独订管子，把剩余的buffer利用起来。 |
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r******g
发帖数: 600 | 21 You can order columns and make the buffer on your own. All recipes are very
standard and available from Qiagen site. My homemade QF, QC, P1, P2 always
work well. |
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s******s
发帖数: 13035 | 23 柱子多数应该没问题把，倒是buffer可能问题大点。
你不放心的话，最后的wash和elute自己用RNAse free的水配
一下，有点残留也该洗掉了 |
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d****i
发帖数: 2346 | 24 目前在做小肠组织的western，给RIPA buffer把SDS加到2%，然后sigma的protease
inhibitor cocktail加标准量的4倍(标准量是1：100稀释用的)，但是每次lysate里面
都有蛋白降解。。。。。。。。所以想除了inhibitor cocktail还能加点啥瞬间灭火
protease还能用于western？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 25 同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 26 同时再问一个问题：
昨天做western，上完样品就把lysate(已经加了sample buffer)顺手放在桌子上了，然
后走的时候忘了收到冰箱，在试验台上放了一晚上。问一下，蛋白会不会降解？ |
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y****i
发帖数: 2194 | 27 温度是关键，一定要迅速降温，整个组织先扔到ice cold pbs里面冷却
然后再捞出来上lysis buffer
要是还不行 可以混用两种cocktail, roche+sigma, 各自用1x
还有就是如果只是western DTT, EDTA之类都可以招呼上 |
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z*********8
发帖数: 1203 | 28 我做过这个实验，用液氮ground tissue，然后加点buffer，直接hypotonic lysis了，
感觉效果还可以，不过我整体感觉tissue尤其是gut里面protease， RNAase都比较高。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 29
我是从液氮里直接拿出来的，扔进lysis buffer。。。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 30
你的意思是先研成干粉，然后加lysis buffer？ |
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s******y
发帖数: 28562 | 31 以前我都是这么做的。先在液氮浸泡里磨成干粉，然后直接加lysis buffer煮了。 |
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i***l
发帖数: 1656 | 32 i am telling you the trick i used
you are questioning me about my trick
what do you want to hear from me?
before asking"3-4M urea会不会太高了" have you check why use urea and what's
the usual range of urea used in denaturing buffer?
what's the conc. you think is better? |
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D**A
发帖数: 311 | 33 protease inhibitor 加够推荐的量就可以，多加浪费钱，效果还不一定好，可以加点
PMSF, benzamidine, EDTA之类的便宜inhibitor, 隔1-2小时补加一次就可。15%
glycerol.
先用液氮冷，然后快速解冻, 加冷的lysis buffer试试。
蛋白在室温下过夜会水解。
能想到的就这么多了。 |
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d*****r
发帖数: 45 | 34 我们一直用 Stratagene's QuikChange "XL" Mutagenesis Kit 做single mutaion，
最近想试试看别的pfu，发现pfu啊，dNTP啊什么的都可以换掉
但是 stratagene kit里的 "quick solution"还是很有必要加的
说明书里没有写这个buffer成份是什么
google了一下有人猜就是pure DMSO，不知道真的假的
请问有人知道吗？谢谢！ |
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y*****5
发帖数: 567 | 35 This quick buffer is not necessary at all. You do not need to add it to your
reaction. |
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m*******e
发帖数: 90 | 36 感觉像是。
我用的是4x loading buffer，都沉在底部，细胞裂解液都在上面……
哭死，是不是没法用了？ |
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d****i
发帖数: 2346 | 37 估计悬。有次我没加loading buffer煮了一下都悬起来，然后再也弄不成均一溶液了。 |
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V******t
发帖数: 444 | 38 用BCA？得稀释多少倍啊
2X laemmli buffer： Solution contains 4% SDS, 20% glycerol, 10% 2-
mercaptoethanol, 0.004% bromphenol blue and 0.125 M Tris HCl, pH approx. 6.8.
那么多SDS BME 会干扰啊。 |
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e****s
发帖数: 1125 | 40 好像可以只加SDS来裂解细胞，
SDS在0.1%以下，对检测结果的干扰就不大了。一般测总蛋白，起码稀释100-500倍，
SDS浓度就不高了。跑胶的时候再和正常的Laemmi buffer混起来。
.8. |
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s******y
发帖数: 28562 | 41 会！
不会酶降解但是会出现化学降解，因为laemmli buffer是一个碱性溶液，会自发水解蛋
白。
不过3个小时应该还有救。如果是过夜，直接扔了算了。 |
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r******k
发帖数: 446 | 42 sunny老师 一定要液氮速冻吗？ 直接放-20 或者-80不行吗？
有的时候有事儿 把lysis 直接放-80 或者-20 第二天再家sds buffer boil 好像也没
啥问题。 |
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d****i
发帖数: 2346 | 43 身边不同人意见不同。。。。。。。谢谢！
目的是裂解细胞抽取蛋白做western。buffer里还有SDS, GLYCEROL. |
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h*******o
发帖数: 4884 | 44 用个两三次没什么问题
而且不管用什么stripping buffer， 用ECL的都要考虑把target 蛋白的位置错开，如
果不能错开的话还是分开做
尤其是ECL plus或者用pierce的dura/femto， 很容易就把膜烧坏了
而且最好rabbit 和 Mouse的抗体轮换做，这样interference 会小很多 |
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R****n
发帖数: 708 | 45 多谢！其实我也刚定了那个kit,要是时间太长，就自己配buffer吧
点。 |
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R****n
发帖数: 708 | 46 今天简单一下，虽然不好看，但是意思出来了，似乎核有点结块问题不大。见图，还有
几个问题。
1）我准备后续做southern,MNase处理后，要不要加RNase A 和 proteinase K,原有
MNase buffer行不行？因为lane 2-5，band之间有smear.
2) 1%的胶跑出去了，理想是多大浓度？
非常感谢！
5- |
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l**j
发帖数: 651 | 47 what are the other common buffers have been tested?
charge |
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l****i
发帖数: 698 | 48 【 以下文字转载自 Biology 讨论区 】
发信人: lengzi (lengzi), 信区: Biology
标 题: 为什么MOPS buffer要protect from light?
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 29 17:28:47 2011, 美东)
下图是MOPS的结构，一般来说都要避光保存。
有没有牛人给解释一下，从结构上说，为什么要避光保存。
最近发现MOPS有一定的还原性，不知道这个从结构上怎么解释，这个分子如何提供电子
的？ |
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f*********e
发帖数: 1144 | 49 Really really weird...
but it looks large precipitation happens if I dilute the buffer containing
100mM Tris.HCl(pH8) + 10mM CaCl2 with PBS (pH7.4)
Only thing I can thinki off is some sort of calcium phospate compound formed
.... is it possible???
Need help from Niu Ren |
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j*****a
发帖数: 92 | 50 阴离子交换色谱 Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences)pH
stability Working Range 2-12 .用1 M NaOH 洗,用纯水洗到pH 7, 换TrisHCl
buffer pH 5.5 平衡, elute pH 变成9.洗了一天还是pH 9. 有人遇到过吗？ |
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