C****1
发帖数: 21 | 1 用evans blue做小鼠brain blood barrier实验，tail vein注射完evans blue以后1小
时，
左心室灌注PBS，然后取脑组织，匀浆后测定。
试了几次都没有结果，有几个问题请教：
1. 取的脑组织直接放入50% TCA溶液进行匀浆，然后离心，取上清测定。
脑组织先在PBS里面匀浆，然后离心； 取上清液500ul，加入50%TCA 500ul，
incubate at 4
度 O/N，次日离心，取上清液测定。
哪一种方法好？
2. 测定的时候，我们试了波长610，615，620，感觉结果都很低。
3. 改用fluorencens测定，用ethanol稀释3倍，比较原液测定，浓度反倒高了。标准曲
线是用
evans blue + TCA +ethanol配置后进行等比例稀释做的吗？
请做过的各位版友帮助，谢谢
再次祝福新年快乐 |
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c*********d
发帖数: 9770 | 2 荒猫牛不耕微信号laoniu003005
功能介绍
好文分享
来源：荒猫之舞
作者：荒猫
中美贸易战告一段落，毫不意外地，咱们又赢了。不过与以往不同的是，这次美国也赢
了，是双赢。据报道，咱们答应了美国减少贸易逆差的要求，所以美国赢了；而因为要
减少贸易逆差，中方将大量增加自美购买商品和服务，这样可以满足咱们不断增长的消
费需求和促进高质量经济发展，所以咱们也赢了。
但让我感觉不可思议的是，这么好的事情，为什么一直不做呢？为什么要在美国政府的
逼迫下去做呢？是因为没有想到？那岂不是说那些人能力低下？是因为想到了而不做，
那岂不是证明了那些人很坏？
而且在美国高调启动贸易战之初，咱们是抱着多大的决心，宁为玉碎不为瓦全，一定要
打赢的，一定要粉碎美国人阻挡咱们大国崛起的阴谋的。当美国提出500亿的清单时，
咱们针锋相对；当美国提出1000亿的清单时，咱们继续应战；而当美国把清单的总价提
高到2000亿的时候，一夜之间，美国就不是阻挡咱们大国崛起，而是有利于咱们大国崛
起了。美国的要求原来是有利于咱们的发展，而不是遏制咱们的发展了。我恍然大悟：
原来以前的针锋相对，是用的激将法，是为了刺激美... 阅读全帖 |
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B******e
发帖数: 23 | 4 http://bestfashiontip.blogspot.com/2012/02/blog-post_5312.html
女人要美丽健康，有三阶段不能忽视：，即是：1.青春期 2.坐月子 3.更年期。
此次只针对「更年期」做说明，此乃我家的私传。如果想知结果看我外婆80岁了没有颈纹、耳聪目明、脑袋清楚、皮肤细滑。身高160公分、腰围25.5吋、没高血压、心脏病、胆固醇等老人病…还可以跟我上天空去玩轻航机呢。
至于我妈年近50，看起来才30多，除头发乌黑外，皮肤可以比美25岁年轻女孩细致晶亮，没毛孔还Q弹喔!! 女生请注意，保养好-身材可以二度发育喔~~~真的也。至于男生我比较不知啦，但听妈妈说可以还是一尾活龙。
而所谓「更年期」保养，其实是指在发生前就要做好保养，如来不及没关系，发生后2年内还来得及喔。台湾根据统计，女性更年期在47-53岁间。男性53-58间(特殊者自行看者办)通常维持1-3年左右。
请注意在此期间绝对不可吃冰的食物(包括棒冰、冰淇淋、冰水、冰水果、冰牛奶、太冰的生鱼片、优格、冰布丁…等)如真的很想吃，请退冰后食用，至于棒冰、剉冰跟冰淇淋就自己看者办。真的吃了，回... 阅读全帖 |
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M****e
发帖数: 70 | 5 refer to NAR 1991 19:42 P.W.Laird et al
i have tried to optimize the condition and it works pretty
well for me. basically, cut ~5mm tail when the mickeys are
about 14-d-old (do not forget ear tag), if you worry about
cross-contamination, clean scissors with 70% ethanol and
flame, otherwise, i typically clean it after collecting 5
samples. digest the tail in a tightly sealed epp. with 500ul
lysis buffer, 5ul proteinase K (10mg/ml). rotate O/N at 55C,
though 6hrs is pretty much sufficient. spin 10 |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 Use curtain gel.
(only has two lanes, a small one for marker, and a huge one for about 500ul
loading space) |
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f*********r
发帖数: 1233 | 8 我比较喜欢这个公司的二抗。条带清晰，特异性高，交叉反应比较少，背景干净。价钱
不贵。500ul还不到200块。
不过用licor机器，blocking的时候和稀释抗体的时候，最好用专用的blocking buffer
。一般是licor自己出的buffer，或者是rockland的buffer。用albumin配或者用奶粉好
象效果不太好。好在buffer可以回收再利用。 |
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a**o
发帖数: 53 | 9 脓杆菌电转感受态很简单，过夜的菌液，很浓，不需在意OD，用冷水洗5遍，（10%甘油
洗一下），10%甘油重悬。10毫升菌液可以最后重悬在500ul里。电转2.5kv, 400欧，~
7ms. 加1ml培养基，复苏2小时。对于质粒转化，涂1ul就可以得到很多colony. |
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w******e
发帖数: 1187 | 10 你说microspin是指500ul volume的那种吗？那我用的就是（ultra-0.5）
anyway，千老之王觉得不错我小就放心了。就是有点心疼那么贵的蛋白呵呵。 |
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f******k
发帖数: 856 | 11 5mg加300ul，那260mg要很多了，要我做的话，我可能会加500ul。只是我的意见啊，仅
供参考 |
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c******y
发帖数: 148 | 13 个人的配方。
13% tris tricine分离胶 stock 4摄氏度不超过4周
40%丙烯酰胺 156ml
3Mtris HCl pH 8.45 160ml
10% SDS 15ml
H2O 113ml
甘油 36ml
每100ml加10%APS 500ul， TEMED 20ul
stacking gel， 现配
40%丙烯酰胺 1ml
3Mtris HCl pH 8.45 3.33ml
10% SDS 0.31ml
H2O 5.35ml
每10ml加10%APS 100ul， TEMED 10ul
15*Anode buffer
3M tris Hcl pH 8.9
5*Kathode buffer pH 8.25 用时稀释1*，加0.1% SDS
0.5M Tris
0.5M Tricine
分离胶可以考虑16%，也可以做成10-16%梯度胶，不过分子量小的话，不梯度也行 |
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m**z
发帖数: 787 | 14 CD需要的蛋白量是很少的，一般~10 uM,就可以了，体积应该是400-500ul的样子，不同
的仪器和cuvette可能会不同。50 mM phosphate有一点高，另外NaCl也会影响。不过这
些影响主要都在far UV region (180-200nm).对于看二级结构的话应该影响不大 |
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w***e
发帖数: 269 | 15 找一个最细最小的针头和针管。500uL 或者1mL 都可以。每个样品抽吸吹打15-20下。样品就不会很
粘稠了。 |
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s****a
发帖数: 454 | 16 首先非常感谢楼上几位的回复.
(1)取材的时候洗组织的液体里面加了CHX
(2)用了电动机子,上样了 1５,２０,２５,３０,３５,４０%的蔗糖梯度.
３８０００ｒｐｍ,２ｈｒｓ,SW41ti 转头.
(3)取样,电动的机子,20fractions,每个500ul,
(4)分光光度计读得OD260.
我做了个读数的曲线,大家帮分析下我标的对不对,那我收集polysome的箭头标记的准确
吗?
这两个分离实验只是在组织匀浆的时候方法不同,其他的都一样. |
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j******3
发帖数: 5244 | 17 多谢大家回复
我的样品体积大概500ul，所以其实总量也比较少
但是我不需要定绝对量
我只需要比较不同样品之间的相对量就可以了
目前看来可能elisa是比较方便的选择 |
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s******y
发帖数: 220 | 18 做subcellular fractionation， nuclear fraction 好像没得到。
看文献说，lyse the nuclei with 10 passages through an 18-gauge needle.
这个是不是就是把lysate suspension load 到syringe 里面，然后推出来，再重新
load，反复来十次呢？
有什么要注意的吗？ 谢谢。
还有就是好像最初的tissue lysate 在centrifudge之前也要filter 来去除debris，
能同样的用这种syringe filter吗？needle
也是18 gauge吗？
因为我的量比较少，大概300-500ul把，有什么好的filter 方法请推荐一下，谢谢。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 19 如题，最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因
A后，对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表
达）。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。
我想问一下，第二种方法是否合理，虽然两种方法我都在文献上看到过，但是私以为第
1中方案似乎更为合理，但是在我们的实验中，它对renilla的影响实在太大。
另外，想问一个lipofectamine2000的转染问题，以6孔板... 阅读全帖 |
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s******y
发帖数: 28562 | 20 只要你乐意，上多少都可以。但是峰会变胖
一般而言我从来不上超过200ul的样
但是蛋白本来就很纯的时候也有500ul 的。反正就是出来一个胖峰。 |
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b**********8
发帖数: 349 | 21 最近开始自己包装慢病毒shRNA，用的是之前组里师姐的protocol，基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒，效率很高，基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次，浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞，细胞生长速度明显
延缓，形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低，在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT，效率很高，24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达，然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞，24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP，说明包装过程中所用的包装质粒，试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问，请有经验的战友指点：
1）师姐留给我的protocol上，转染HEK293FT的方法如下，以10cmdish为例：
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pL... 阅读全帖 |
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F*****e
发帖数: 182 | 22 1. 100mg tamoxifen in 1ml 100% ethanol, vortex for 2-5mins.
2. Add sesame oil to 10ml, leave it on a shaker until fully dissolved.
Aliquot into 500ul/tube and store tubes in -20oC for 1-6 months (final
concentration: 1mg/100ul).
3. Oral administration: 250-350ul/25g body weight. |
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F*****e
发帖数: 182 | 23 1. 100mg tamoxifen in 1ml 100% ethanol, vortex for 2-5mins.
2. Add sesame oil to 10ml, leave it on a shaker until fully dissolved.
Aliquot into 500ul/tube and store tubes in -20oC for 1-6 months (final
concentration: 1mg/100ul).
3. Oral administration: 250-350ul/25g body weight. |
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l********s
发帖数: 70 | 24 我做的是tissue，至于具体多少细胞不敢确定，只能用input 来确定。 我觉得应该有
binding区域吧，histone的，很global的。 谢谢，
我是500ul lysis buffer 后 sonication，
然后吸出100ul lysate 再加900ul dilution buffer。
用agarose G洗过后，从1000ul 里抽出100ul 做IP， 100 做IgG 100做target。 别的
保存，不知道这样行吗？谢谢 |
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s*****i
发帖数: 315 | 25 Eppendorf 有可以精确到50ul的，电子的，最大500ul
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 7.8 |
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d****i
发帖数: 2346 | 27 lysate总共也就300-500uL，除了冻干还能怎么浓缩一下？ |
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R******0
发帖数: 6158 | 28 有起始体积500ul的centricon，最多可以浓缩到20ul左右，不过膜本身可能吸附很多蛋
白，样品宝贵的话还是要慎重 |
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z********8
发帖数: 818 | 29 谢谢你的讲解。 我做过药理，但是不懂毒理。如果10mg/g，是一次性口服，那这个剂
量，还是非常的高，如果溶解在水里，就是100％的浓度了。呵呵。 当然了小鼠口服
500ul 是没有问题的，但这不影响你的结论。
“EPA不要求bt toxin做积累毒性主要是由
于高剂量下0 mortality和没有clinic signs，而不仅仅是急性毒性低。任何一种农药
只要符合这种条件，EPA应该都不会额外要求积累毒性的。“
你的意思是由于急性毒性实验中没有发现mortality和没有clinic signs，就不需要做
超过90天的长期毒性试验了？ 我的意思是按照国家申报标准要求，就是按照protocol
。 或者国家有没有关于主要农作物转基因食品的毒性试验标准。
bt |
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r******k
发帖数: 446 | 30 大神你好 比如我10cm的dish ， 那加500ul sds loading buffer？？？ 然后收下来煮
了？ 再IP？ 但是这样也不能再稀释了把？？？ |
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r******k
发帖数: 446 | 31 小弟最近做一个蛋白的磷酸化 以为没有特异性的抗体。 只能IP total的protein 然后
用Pan-Tyr。 但是这个磷酸化总是出不来。班上有大牛说用预热的（90度以上？）SDS
loading buffer 挂下来以后直接boil再稀释10-20倍做IP。 但是有一个问题，10cm的
dish怎么也要用500ul的loading buffer scrape下来吧？ 那也无法稀释了呀？
难道先用pbs刮下来？？ 而且这个PBS是冰的把？而且还有protease inhibitor 还有
phospho-stop？ |
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n***w
发帖数: 2405 | 32 check this article for methods.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8621645
basically, if you have pellets from 10cm plates, resuspend the pellets in
500ul 500 mM sodium carbonate (pH 11), sonicate (3X/15 s). The lysate is
mixed with an equal volume of MES-buffered saline containing 90% sucrose and
centrifuged on discontinuous sucrose gradient (45%, 35% and 5%) for 16 h at
175,000 g and fractions will be collected for analysis.
, |
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发帖数: 1 | 33 个人觉得，不管nucleofection还是lipofectamine的实验，应该都是先用很多细胞在比
如6-well plate里做转染，等到做luciferase的时候，用500ul 裂解液裂解，这时候分
成3-5个孔（每个孔100ul裂解液）进行luciferase assay，那么这里的3-5个孔也可叫
做technical replicate？
或许我的做法搞复杂了？
5
孔。 |
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l******3
发帖数: 24 | 34 250ul 到 500ul PBS重悬细胞后，用1% formaldehyde固定，发现立即结团。各位大神
觉得是什么问题？
也有试过直接在dish上固定细胞，然后刮下来，似乎大部分都是结团的细胞。好苦恼啊
！ |
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S*****n
发帖数: 6055 | 35 要求流速5-500ul/min
承受压力500psi以内
耐水、醇类溶剂
越便宜越好
如果可能的话，有一定耐酸碱性
多谢！ |
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d******e
发帖数: 58 | 36 google syrange pump
不过基本都不是很便宜
要求流速5-500ul/min
承受压力500psi以内
耐水、醇类溶剂
越便宜越好
如果可能的话，有一定耐酸碱性
多谢！ |
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p**********m
发帖数: 472 | 37 从ｃｈｒｏｍｔｅｃｈ查下面两个东西，肯定不漏。
81220 1750TLL 500ul SYR
p-659 luer adaptor
可是直接跟tubing连起来。 |
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