n**********u
发帖数: 77 | 1 我最近用promega的Gotaq酶做pcr，然后再TA克隆。 情况是这样的：我循环是40,后面
有10min 72度extension.但是就是连接不上，pcr product跑胶后的条带是很亮的。 我
怀疑是我的TA kit的问题，但是也不是，因为我把我的pcr products 中浓度较弱的几
个当作template再来一次short-pcr后（15cycles,然后10min 72度extension）得到的
产物回收再做TA克隆，得到满板。这说明我的TA克隆是正确的，就是pcr的问题。 我怀
疑是开始的循环数太多了，就降到35个循环，但是还是不行。 后来我又怀疑是我的酶
和体系出问题了，pcr的产物可能没有加上A尾，我加大酶量和dntp的量。 但是还是不
行。我后来又做了加A尾的实验，换了fermentas一般taq酶，也还是不行。大家说可能
是什么原因。
我的pcr体系：
20ul体系
H2O 9
5*GoTaq color buffer 4
dNTP（2mM） 2
mgcl2（25mM） 1.6
BSA（100mg/ml） 0.15
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b********i
发帖数: 73 | 2 It is quite interesting to hear about caspase-independent apoptosis (actually first time), are u sure it is
apoptosis instead of necrosis, or autophagic cell death? Back to your question, three major papers from last
yeay (Xiaodong Wang, Jiahuai Han, Ka-Ming Chan), 20-50 uM zVAD was used to block pan-caspases
activation. In my hand, 20uM is also enough in most of situations. I do not think you need more than 100
uM. |
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s********l
发帖数: 58 | 3 谢谢您的答复。我们也是第一次遇到，查pubmed才知道caspase-independent
apoptosis。ZVAD在每个细胞系的合适用量应该也是细胞特异性的吧。同事用20uM也说
效果很好。
怎么区别apoptosis from necrosis, or autophagic cell death? 感觉我说的
apoptosis是一种广义的说法，我也不确定是否真的是apoptosis。
actually first time), are u sure it is
question, three major papers from last
to block pan-caspases
not think you need more than 100 |
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p*3
发帖数: 45 | 4 From what I heard, 20uM is supposed to inhibit caspase 8. Higher
concentrations (50-100uM) is assumed necessary to inhibit other caspases. |
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o2
发帖数: 2764 | 5 Did you get the point? We are saying the crystal size is too small, if the
same size as beam (20um), how could we did not find them under microscope.
We are talking about screen nm size crystals |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 蛋白降解一般而言可以至少有两个途径：proteasome, lysosome, 再加上limited
proteolysis by calpain or other proteases.
前者可以用MG132 or beta-lactone
中间可以用100mM NH4Cl
后者可以用calpain inhibitors
MG132 本身是一个小多肽模拟物，一般认为是堵塞chymotrypsin-like cleavage
activity. 所以其实也不是一个很干净的inhibitor, cross-react with calpain and
other protease. 但是它在浓度比较高的时候(20uM) 对proteasome 抑制
是非常明显的。
beta-lactone 主要通过和proteasome subunit crosslinking 而起作用，比
MG132 专一性稍微好一点点，但是抑制作用不是特别明显。
不管哪个inhibitor 都不能完全解决问题。我不能说你的导师到底是对还是错，
但是你应该找其他方法来佐证。比方说，你可以看看蛋白用这个东西处理的时候，
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g*********5
发帖数: 2533 | 7 10uM lactacystin?
MG132 20um？ |
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f*******e
发帖数: 354 | 8 10-20uM in mouse ES cells |
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c*u
发帖数: 916 | 9 那里可以买到bonding wire？越细越好，最好有10um的，要不然，20um也行。 |
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c******k
发帖数: 1140 | 10 请问run 这个slab waveguide 的slab mode时的slab宽度设置多少合适？
不同的slab宽度的1st order slab mode的Neff 还不一样啊，
比如现在设成
20um width: Neff=3.363936（1st order slab mode）
10um width: Neff=3.363858（1st order slab mode）
Nref |
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c******k
发帖数: 1140 | 11 You help me a lot! Two more questions:
1.The calculated Neff of a 0th slab mode with various widths as follows:
1.6um: 3.364379
10um: 3.363858
20um: 3.363936
50um: 3.364155
100um: 3.364166
You suggest me to choose a slab width that is close to a real situation.But
in fact we can consider the slab width to go infinite.So right now I have to
choose Neff with 3.364 as an average value. Any comments about this value?
2. If I keep other parameters same for a ridge waveguide, but just change a
ridg |
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p*****i
发帖数: 186 | 12 非常感谢你的答复
我们每天取样100克，然后统计小于10um的有多少克，小于20um的有多少克，小于50um
有多少克。 这样其实就是百分比，对应P值。然后用正态拟合，得到平均值和方差。
现在想比较去年的结果 和 今年的，看看有什么不同。你的方法 是否需要求出每天的
平均值？ 这样不需要考虑每天的样品的方差么？ |
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p*****i
发帖数: 186 | 13 我们每天取一个样， 然后每个样测3个值，和我刚才说的，例如小于10um的particle
有10g, 小于20um的particle有20g, 小于50um的particle 有50g.因为particle和 百分
比是正态分布的，所以每天的样品都可以求得一条正态分布曲线
weiwei的说的方法只比较一个值。但是我们还想关心我们的particle的平均值和方差。
这样我们可以估算在某个区间的particle size的百分比是多少
我们还想对比今年和去年的particle size, 这是我stuck住的地方。 看看各位统计专
业的朋友有什么办法么 |
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p*****i
发帖数: 186 | 14 我们假设知道是符合正态分布。。。 而且我们用正态分布拟合也挺好
我们是用筛子筛<10um , 20um , 50um ，所有是P值 |
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