t*****z
发帖数: 1598 | 1 我抽的一些质粒，尺寸在15kb以上，把它们放到一般的琼脂糖电泳（0.8-1%）上去跑，
跑出来的结果，往往不是常见的开环和超螺旋的样子，而是几条带，目前还没有找到这
几条带的分布、亮度、出现频率和电泳时间、电压、胶浓度、上样缓冲液、上样量等等
之间的关系。看上去就好像质粒自己断裂成小片段了的样子。但是酶切鉴定，却没有杂
带，说明质粒是完整的。QIAGEN的手册上说，对于像BAC这么大的质粒，开环的会跑得
比超螺旋还快。我的15kb也没到BAC的程度，难道发生了同样的现象吗？
不知谁有类似经历的，分享下经验。多谢！ |
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h*******3
发帖数: 3775 | 2
to
谢谢你了。
这个iso下起来真是慢啊。我用的迅雷离线，现在都是15kb/s。
猴年马月也下不为万，这东西有5g大。 |
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l*****u
发帖数: 12114 | 3 How does SMRT sequencing differ from other existing next-generation
sequencing technologies, and what benefits does it bring?
SMRT sequencing is a single molecule technique that can generate long reads
(10-15Kb), is highly accurate and can distinguish methylated bases from the
normal A,C,G,T.
Given that Pacific Biosciences’ SMRT sequencing has been subject to
negative rumors, how did you come to realise that this technology is
actually a valuable and accurate tool?
My original principle interest... 阅读全帖 |
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f*******i
发帖数: 8492 | 4 开机，用那个账户登录一下PSN store。
从下载历史中，随便下个几Kb的东西就行，比如下载super rub a dub的激活文件，大概15KB左右 |
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R***a
发帖数: 41892 | 5 【 以下文字转载自 Joke 讨论区 】
发信人: xtxtxttchris (chris), 信区: Joke
标 题: 求安慰
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Aug 5 15:15:33 2011, 美东)
远程到同事电脑上下载一个软件，800m，虽然有点大，不至于从昨晚10点下到现在还显
示4hours remainning.... speed一直在14kb，15kb徘徊。最担心的还是害怕网络突然
断掉了。。
网上兴高采烈下单个GF2，到处跟人家说是白色的，拿到手打开一看是银色的。颜色错
了就算了吧，以为至少能拍个景深出来吧，广告里不是美女拿手轻触触摸屏一张张大师
级的照片就出来了么。。。
郁闷的周末呀 |
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x**********s
发帖数: 6296 | 6 远程到同事电脑上下载一个软件，800m，虽然有点大，不至于从昨晚10点下到现在还显
示4hours remainning.... speed一直在14kb，15kb徘徊。最担心的还是害怕网络突然
断掉了。。
网上兴高采烈下单个GF2，到处跟人家说是白色的，拿到手打开一看是银色的。颜色错
了就算了吧，以为至少能拍个景深出来吧，广告里不是美女拿手轻触触摸屏一张张大师
级的照片就出来了么。。。
郁闷的周末呀 |
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M******t
发帖数: 555 | 7 恩,准备从BAC中选一段大约15KB的region克隆到retrieval vector.但关键是还得做个
point mutation.这么大的plasmid很没把握,有什么好的技术推荐吗?谢谢. |
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M******t
发帖数: 555 | 8 要做个targeting construct,准备clone一个~15kb的bac片断到retrieval vector，如
何做我们要的那个point mutation最
有效？有经验的同修说说。非常感谢！尽量自己做了，帮老板省点。 |
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r****r
发帖数: 379 | 9 一般大片段克隆，会导致连接效率很低，克隆数大大减少，可以看看你的克隆数和你常做的克隆比是不是还比较正常，如果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重组，试着30度长克隆和摇菌看看。另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
另外，单就大片段克隆而言，建议用GeneHogs菌株，我手上的片段普遍10k以上，用这个菌株，从来没出现过问题，感受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
因此建议先更换单酶切策略和换genehogs，然后不行再换30度生长看。30度生长，已发生重组的质粒，一般10个有2个总是对的。
gone
cut |
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b******r
发帖数: 111 | 10 Good idea. My 9kb DNA itself contains too many restriction sites. NotI is
the only choice.
'Description:
Important: GeneHogs® competent cells are being discontinued on December
31, 2007.
Use ElectroMAX™ DH10B™ T1R cells for exceptional performance!
'
常做的克隆比是不是还比较正常，如
果比较正常，那说明这种假阳性很可能是因为你的插入片段有一段序列比较容易发生重
组，试着30度长克隆和摇菌看看。
另外，能不用单酶切做克隆就不要用，你大片段克隆还用这个策略，最好换其它双酶切。
这个菌株，从来没出现过问题，感
受态效率一般7次方就可以了，15kb可以长百来个克隆。
发生重组的质粒，一般10个有2个
总是对的。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 11 大家出现过大plasmid每一批提纯跑出来的条带大小都不一样，更甚而每一次跑胶大小
都不一样的情况么？我正在做大plasmid连接，十分困惑 |
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f*******e
发帖数: 628 | 12 没有 linearize? supercoils |
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H*********8
发帖数: 323 | 13 用某个 基因 的启动子驱动cre ，用 的 是bac载体，转进一个报告 基因中，如果cre
work，报告 基因就转换颜色。用电穿
孔转这个bac，有对照组，用的商业性 的pgk启动子驱动cre，几乎80％以上 细胞颜色
转 过来 了。但bac里 转的 没有，这
个bac智力绝对没 问题。我怀疑电穿孔转bac效率太低，但用15kb的智力试电穿孔 的
效率能 达到25％多。我的 bac大概
250kb，大家 有 什么 好的 方法。做了1－2个月了，很郁闷。请赐教。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 14 菩提MM,开个公司吧，给版友干点儿私活儿也行。建议业务如下：
1. 只做四个片段以上的链接（注：不含载体）；
2. 只做15kb以上的PCR及克隆；
3. 专治各种克隆不适；
4. 欢迎补充。
谢谢！ |
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q*****d
发帖数: 445 | 15 我是做合成生物学的，想构建一个新的代谢通路，需要表达很多基因，但是不知道酵母
细胞转化质粒的大小上限是多少？比喻一个30KB的质粒能够通过LiAc方法转化吗？BTW:
我做过最大质粒整合是15KB的。 |
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H*g
发帖数: 2333 | 16 The longest I've done is around 15kB and to insert 2 kB, very very tricky
and picked a lot to get the correct one~
Not sure about 22KB, I guess it is worth trying. |
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C*********m
发帖数: 213 | 17 质粒本身7.5kb左右 加两三个1000a.a.的基因总长度超过15kb-20kb
phenotype层次说top10有mcr突变，转甲基化的DNA容易一些。DH5alpha没有看到。 |
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n********k
发帖数: 2818 | 18 In vitro or in vivo study?
try to cut down ur backbone as much as possible, dependent on which vector
you use, this could be like 12-15kb, anything above 11/12kb is a bit
struggle and above 13/15 is a big one...
BTW, not my personal experience but common knowledge from the field, the
longest oone I worked is about 12kb I believe...it was fine...not great
though |
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m*********D
发帖数: 1727 | 19 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
低点，3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点，我几乎每次都
能用上。其他的看运气，识别8 ... 阅读全帖 |
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m*********D
发帖数: 1727 | 20 12kb应该可以，commercial的competent cell应该可以了。我都用我们这里facility作
的competent cell来作克隆（10bucks/ 1 ml)。只有作mutagenesis或大于15Kb的时候
才用commercial的。
死活作不出来的，我会换vestor.一种考虑就是克隆进去的这个片断产生有毒的protein
。这种概率不大，但有可能。 |
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发帖数: 1 | 21 我想纯化 100bp 到15kb 的DNA （小量纯化）， 请问大家推荐什么牌子。Qiagen 太贵
了，
谢谢大家 |
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h****l
发帖数: 7290 | 22 【 以下文字转载自 BUAA 讨论区 】
【 原文由 leaflife 所发表 】
The following is some ideas, maybe it will work. It's owned
by a white person in US.
nope. i don't have enough bandwidth to support the site. heh
my upstream speed is limited to 15kBs.
using load balancing with my office line, i could get it to
60kBs tho.
tellt hem to ask unc.edu. or carnigie-mellon.
maybe for free.
if they approach them with the arguemnt that they are trying
to help support free speech in china, might be able to get
it hosted for free. |
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