f*****r
发帖数: 84 | 1 最大只做过80多kd的，不知道150kd 行不行。 thanks! |
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j********i
发帖数: 116 | 2 哦，既然是Dose的问题，那就来个小剂量的，肉毒杆菌毒素，150kd的20种氨基酸组成
的纯蛋白，来10纳克给你妈尝尝咋样？这个剂量可超小吧，只有1克的一亿分之一啊
toxicity |
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s******y
发帖数: 28562 | 6 For detection of protein peak you can use UV absorbance at 260nm. Most
protein has intrinsic absorbance at this wavelength.
For the column, since your protein is big, you can use either Sephedex G-100
(usable for proteins of 40~150kD) or Sephedex G-150 (usable range up to
300kD)or any gel filtration column that can fit your protein.
Since you are not familiar with the chromatophraphy, I suggest you to
collaborate with a protein lab and ask them to do it for you, or at least
assist you to do it. |
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m**z
发帖数: 787 | 7 self-packed column usually has lower resolution... 150kD and 500kD will
probably run very close from a Superdex200 column to start with. A self-
packed column may not be able to separate them...You may need to pack a long
column... the longer column, the better resolution you get |
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a***a
发帖数: 40617 | 8 一个150kd，一个还大于500kd
不用UV都行，只要你柱子合适（s200）且上样量足够
组分手工收集的细一点（analytical的柱子，bed vol约28ml），那就0.5ml一个组分
prep柱子，bed vol约120ml，1ml一个组分
然后每个fraction取一点做bradford就可以判定峰的位置了（可以肉眼直接看）
如果你上样量不够，你没有连续动态监测UV的装置（如FPLC上自带的）
光靠取样用比色皿去自己测，那误差和variation都够你喝一壶的，你根本无法判断
峰的位置
结论就是
上样量必须够。如果上样量不够，还是得FPLC，虽然也是用UV的，但是那个很稳定
variation小，所以灵敏度和复现性都远远好于你用比色皿
这个讨论我看了半天，跟以前好多次一样，感觉学生物的大部分还是停留在书本 |
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a***a
发帖数: 40617 | 9 那就要Q和S同時上樣，然後分別洗脫。但是還是我說的，你不知道哪個是那個（哪個
peak是aggregate）
你還要考慮不一定aggregate和150kd的在ion exchange上可以分開 |
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s******y
发帖数: 220 | 10 我做mouse NFAt c3的IP, 预测的分子量应该是115Kd， 我IP下来大概100Kd有带，
但是input 里面分子量变大了快到150Kd，（略小于100也有浅带，但不是IP那条）
为什么会这样呢？
有人说可能是sumoylation， 可是为啥IP下来这修饰就没了呢？
谢谢。 |
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s******y
发帖数: 220 | 11 好不容易，被针扎了以后，结果有了improve：）
我提取了nuclear fraction后，那个suspension很黏糊糊的，应该是DNA很多的原因吧？
anyway，我用针头fitler了好久，然后做WB。
结果能看到我要的带，但是背景很高，看图，
我又把膜多洗了几遍，也没明显效果，请问有什么办法，能消除背景吗？
很明显，旁边的cytosolic 同一个蛋白，就没这个背景问题，谢谢。
BTW, 目标蛋白是150kd左右的那个，图片上是不同的曝光时间的结果。 |
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y******8
发帖数: 1764 | 12 依照经验，total protein没有over-load，lane之间的差异在20%以内。
150kd附近的带，量差异在100%以内。
p53, p21 positive的lanes比，量差异在5倍以上。
by |
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l**x
发帖数: 52 | 13 以前western转膜最大的蛋白也就150KD左右，对于utrophin这种接近400KD的蛋白对转
膜有什么特殊要求吗？先谢过了 |
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f*****f
发帖数: 195 | 14 目前正在做一个蛋白H。见附件GFP-H在293中表达：blot anti-GFP，H理论大小130kd，
GFP-H 150kd上面总有很深的背景。flag-H blot flag也类似：在130kd上有类似很深条
带。
蛋白可能有修饰么？泛素化？但好像一般泛素化检测需要转染Ub后才比较明显（不太清
楚），有类似例子么。
或是293 over-expression 有时会出现这种情况。
重复过多次不同的cell lysates，所以上面的背景应该不是实验操作原因。
谢谢 |
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b*********8
发帖数: 44 | 15 我在烟草中共表达A/HA 和 B/Myc。然后用 anti-HA agarose bead from Sigma来纯化
，用anti-myc来检测.
1. 在50K-200KD,为什么有很多的背景带？如果曝光时间短点， 总蛋白中的背景带很少
，但IP中的
背景带还很强。请问是什么原因，如何解决？
2. 因为我有个蛋白约150KD, 正好在背景区，而且表达量比较低。请问这类蛋白浓缩一
下是否效果会好些？
3. 很多用anti-HA 或anti-myc结合Protein A/G 来做Co-IP， 也有用MIltenyi biotec
uMACS protein isolatio kit来做。那个效果会好些？
非常感谢！ |
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K**R
发帖数: 193 | 16 请教大牛们个问题，有一段基因cDNA 大概编码1200多个AA，predict的蛋白应该是
150KD.
为什么western条带大于200KD. 好几篇文章已经说这个条带是目的基因
我想问问呢大家，为什么条带差异这么大？ 为什么？是被转录后修饰？ 还是cDNA其实
是不完全的。可能有替换性拼接？
非常感谢！ |
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H****n
发帖数: 26 | 17 最近做一个Transcription Factor（120KD）的ChIP， 很奇怪的事情，--
前面标准的1% formaldyhe RT 10min，0.125M Glycine RT 5 min, PBS wash,
裂解完细胞后，温和的sonication完后，input用western看发现原来条带的位置没有（
或者变的很淡），在下面有两条小的蛋白带。 做了一下RNA pol-II的WB (>150kD <
200kD)也是类似的情况，原来条带的位置淡了很多，在底下出现了两三条size小的条带。
先后试了RIPA (0.1%SDS)和nuclear lysate(1%SDS)裂解，效果一样。只要有
sonication,即使是很温和的5个cycle 30s/30s (该条件下DNA shear都不完全200-
3000bp), 原来蛋白条带就会消失，取而代之的是底下出现的size小的条带。
请问这是sonication 导致大分子量的蛋白容易降解吗？要如何解决？ |
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j******i
发帖数: 939 | 18 看来真是个演说的好手！能把生物说的这么激动人心！恕我愚昧，有几个地方不懂。（
1）如果要跟踪protein-protein interation，难道不是用基因编辑的方法在内源蛋白
上加个标记更可行？（2）即使用某种方法把抗体转到细胞质，不是还需要加二抗和底
物吗？（3）我确实有方法将小蛋白转进细胞质，抗体可能太大了（150kd?)，看来成不
了首富了。 |
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z*t
发帖数: 863 | 19 大牛那myc tag呢？
要过表达protein比较大（150kd）左右，一般要不要加？ |
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y****6
发帖数: 196 | 20 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azide modified oligo 反应
。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
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y****6
发帖数: 196 | 21 我需要标记一段50 nucleotide 的oligo 到抗体上，不知道什么方法比较合适？一个方
法是用pierce 的SMCC, 一端连抗体的amino group, 一端连thiol modified oligo；另
外一个方法是click reaction。用DBCO NHS 连上抗体，和Azimde modified oligo 反
应。不知道哪种方法效率高些？
还有就是纯化，dialysis 好像找不到合适的MWCO。有什么好建议吗？oligo 大约15kD
，抗体150kD。
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