x*****e
发帖数: 309 | 1 看来做酶切的人还不少。其实双酶切分两步应该可行，先用对酶切要求比较高（查NEB
附录上需要保护碱基较多的酶）的酶切，反应完后加直接加第二个酶切：不用回收DNA
。这里有人问buffer不同怎么办的问题，查查哪里不同，一般也就是NaCl浓度差异，缺
啥补啥，自己加点调成第二个酶用的buffer就可以了。我现在空质粒双酶切完直接乙醇
沉淀回收（小片段沉淀不下来？）：加2倍体积无水乙醇，可选加1/10体积3M醋酸钠，-
20度大于20分钟，14000rpm*15min回收DNA,70% 乙醇洗2遍，风干后10-20ul水溶解（1-
2 ug DNA），如果有大的插入片段就走胶回收吧。 |
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p*****n
发帖数: 981 | 2 ☆─────────────────────────────────────☆
sixtn (人在天地间如风中飞絮!!!) 于 (Mon Jan 29 00:24:15 2007) 提到:
最近，我在做一个双酶切的连接。最开始，在已经联入T simple vector的A段DNA序列
的一端有相隔四个碱基的两个酶切位点（XbaI和BamHI），然后用双酶切的方法把B段
DNA序列（两端带有相同的两个酶切位点）连进去。跑胶和回收都没有问题，大小也对
。但用T4酶或其它连接试剂盒连接后，再转化，总是长不出来。但其它同学用相同的试
剂做其它连接却能够轻而易举的长出来。已经做了三次了。对于原因百思不得其解，回
想实验过程是再简单不过，加液体这些也很难出错呀。化转也是很简单的步骤。不知道
哪里可能出问题了。
各位ggjj帮我分析一下可能原因好吗？多谢！
☆─────────────────────────────────────☆
goooo1111 (i!) 于 (Mon Jan 29 00:33:53 2007) 提到:
相隔四个碱基是不是少了一点？有些酶不切DNA尾巴， |
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A*******e
发帖数: 284 | 3 谢谢诸位！我这个是因为需要建library，最好达到10(9)，最低也得10（7）才
能说得过去，所以要求很高的浓度和效率。也有可能是自连，就是在两个酶只有一个酶
成功切了，而另外一个没有切的情况下，肯定自连。因为需要连接的效率，所以ALK之
类的处理被排除。也不想分布酶切，因为首先有共用buffer，其次我不想多纯化一次损
失我的vector.按诸位的意见，我打算降低单个酶切反应dna的量试试看。另外我这两个
酶切位点相距12bp，我想不会相互干扰。 这12bp中还有另外一个酶切位点，也是同样
的工作buffer，我想先用双酶切后，再加点这个酶，争取把那些漏网之鱼逮到干掉。
诸位有好主意，请不吝赐教！谢谢 |
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s*****g
发帖数: 87 | 4 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 5 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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s*****g
发帖数: 87 | 6 建议做几个control实验, 可能是连接或者转化的问题：
1. BamHI 单酶切 vector，链接，转化
2. EcoRI 但酶切 vector，链接，转化
3. BamHI/EcoRI 双酶切 vector，只链接vector， 转化
4. BamHI/EcoRI 双酶切Vector 和 Insert, 链接，转化
5. 转化没有酶切过的vector |
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l*******c
发帖数: 478 | 7 曾经尝试做DNA片段连入载体，没成功。有人建议说把其中的双酶切那步分成两步做，
后来试了，还是不行。我想稍后把流程贴上来请大家指导。
我想先问一下：做双酶切（BAMH I 和 ECOR I ），两个酶同时切和分成两次切，有很
大区别吗？你们一般怎么做呢？
谢谢大家啦！ |
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b******s
发帖数: 1089 | 8 虽说理论上这两个酶在大部分buffer里活性都不错。但实际上并不一定所有的组合都好
用。
尤其是有时候在非最佳的buffer里会有star acticity。如果同时做双酶切出现问题，
可以考虑做sequential digestion。你不必每步都抽提，可以先用离子浓度低的buffer
第一个酶先切，然后换成离子浓度高的buffer，用第二个酶切。如果切的时间足够长，
酶量足的话，我觉得不一定要加CIP，这样会促进其后的连接效率。 |
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l*******c
发帖数: 478 | 9 哈哈哈，SHAKURAS你太幽默了！
谢谢楼上大家的鼎力相助哈，太好了，看来我有望解开当年的谜了。
我顺便把酶切的反应量列出来，大家看看。都是FERMENTAS的。
我想问：双酶切对两种酶量的比例有没讲究？
ddH2O 30UL
DNA 7UL
10XTANGO 10UL
BAMH I 2UL
ECOR I 1UL |
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I***a
发帖数: 13467 | 10 有的时候不同的酶用不同的buffer，
如果双酶切的buffer对一种酶活性影响很大时，就分开做，
如果影响不大，就一起做。 |
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s********n
发帖数: 2939 | 11 个人比较倾向于用colony PCR screening，通量比双酶切高不少。 |
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l*******c
发帖数: 478 | 12 to tfmm和ntgxw，DNA的浓度我还得找下当年记录，只记得是按有经验的人建议的量取的。
请问，你们做双酶切一般选择多少ng的DNA？谢谢。 |
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l*********1
发帖数: 351 | 13 因为要长期使用线性化后的载体，想着冻存后封装成小份使用。不知道双酶切载体后的
粘末端是否稳定？有同事说冻了两年以后还能用，不知道是不是这样？
多谢 |
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r**i
发帖数: 514 | 14 dna纯度对酶切效率有影响。
最好每次不要切很多，可以分多份切。
也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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A*******e
发帖数: 284 | 15 也算是在分子这块混迹十几年，再拿这个弱智问题来请教高人实在不堪。直接说吧，低
拷贝数质粒，要切的量很高，要求回收后能达到100ng/ul. 没办法，猛养细胞，猛提质
粒，所有的试剂盒被我抛弃，达不到我的要求，还费钱。手提，溶液1，2，3乙醇沉淀
什么的折腾，量上基本没有什么问题。 两个酶，Asc I 和 Not I, 双切，感谢NEB,这
两个酶现在可以在同一个buffer里切，回收，问题来了，总是切不干净，转化后总有空
质粒，极度讨厌这个转化后的空质粒。酶切的时间都是超过24h， 酶的量也大大的多。
请问这是为啥？ 这还能切不干净？ 还有一个引申问题，是不是所有的酶切都是切不干
净的，如同化学里面的只能达到平衡？请高人指点。
附加问题，达人们有无什么胶回收试剂盒推荐？ 我总觉得现在用的QIA和Promega的效
率不好，从没有达到所说的90% |
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A*******e
发帖数: 284 | 16 请问我两个酶有共用buffer，为什么还要分布切呢？ 空质粒双切后直接乙醇沉淀
后做克隆可以吗？ 这样没有背景？我决定切下拉的片断应该也能沉淀下，这样就会有
背景啊。愿闻其祥，请赐教啊。
曾有labmate双切后用PCR纯化试剂盒做回收纯化，一直不成功，我提醒说这样酶切
的片断也能回收回来，不要迷信回收试剂盒，什么多大的片断回收不下来之类的全不可
靠。后来换胶回收就成功了。
NEB
DNA
，-
1- |
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x*****e
发帖数: 309 | 17 建议1.看看酶活性单位的定义，One unit is defined as the amount of enzyme
required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total
reaction volume of 50 µl. 切超螺旋质粒提高到5-10倍。确定你加的酶足够，
但不要超过总体积的1/10； 2.看看两个酶切位点之间距离是否大于6nt，小于还是选其
他酶吧。3.如果不能同时切，可以先用低盐buffer,切好后再补NaCl变成高盐buffer,加
第二个酶。 Good luck! 其实如果是刚要来的质粒，怎么切都不行的话，还是测序吧。 |
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c****1
发帖数: 1095 | 18 酶切空质粒确实比较麻烦。我的经验是，一次酶切后，纯化，再酶切，再纯化，再酶切
。三轮过后，基本就没有没切开的了。
其实，插入片段也是个方法，你怕环状DNA跑的快，就插入个大点的片段，这个应该难
度不大。
BTW，为什么要这么大量？让我们开开眼？ |
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b******s
发帖数: 1089 | 19 限制性内切酶里是有glycerol的，浓度太高会影响酶切反应。两个酶体积加起来最好不
要超过整个反应体系的20%。你以前链接没成果原因很多。试试不加CIP处理，延长酶切
时间看看。
取的。 |
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m******5
发帖数: 1383 | 20 目的片断连进载体以后，双梅切验证，发现酶切产物比PCR目的片断大：（目的片断
500bp, 跑出来接近800）
请问这种情况正常么？
等测序结果还要三天……忐忑阿 |
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h*****9
发帖数: 4028 | 21 太高了。通常都是1-2ug/50ul。另外你的酶量加太多Glycerol可能会对酶切不利。
回收只要是跑胶纯化，未梅切质粒污染应该非常少。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 22 为什么要这么高的浓度转化呢？ 我每次就切1ug. 胶回收，然后ligation, 转化都能挑
到正确得质粒。还有酶切一般我都不会
切超过2ug／tube. qiagen胶回收。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 23 general rule is : 加入得酶不超过酶切总体积得1/10. |
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p*****c
发帖数: 1506 | 24 不要用空质粒，
找一个这两个位点间有insert的质粒，酶切完以后跑胶，把大小不对没切完全的分掉 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 25 200ul体积实在太大了。 酶切总体积不应该超过50ul. 如果需要切很多，应该分几个
tube, 比如5个tube, 40ul/tube. 跑胶
后在合并起来。我觉得你放太多dna。 |
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C*******e
发帖数: 4348 | 26 反正你要胶回收的
酶切结束以后，只要是NEB的buffer 2,3 或者4，直接加点CIP进去37度1小时就可以了
然后一样胶回收
我不喜欢QIAGEN的胶回收kit
效率不高
绝对没有90%
lz可以试试ZymoResearch的胶回收kit
直接上他们家网站，要free sample
不喜欢也不用花钱买了 |
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b******n
发帖数: 4225 | 27 可能连进了两个拷贝的目的片段吧
你看看两个酶切位点是不是cohesive |
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n***w
发帖数: 2405 | 28 PCR不如酶切好，稍有污染，PCR容易出现false postive...
我做fusion protein都好几个月了。。。现在就是把这个大片段连到backbone里去老是
得不到正确的克隆。。。。 |
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h**********r
发帖数: 671 | 29 最近做一个克隆（NdeI/EcoRI），PCR验证是好好的。用PstI验证也正确。可就是用
NdeI/EcoRI酶切不对。
载体和片段都比预期的要大。而且不知道为啥弥散。
麻烦大家帮忙看一下图吧。多谢！ |
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g*****y
发帖数: 6325 | 30 我双酶从来不用phosphotase, 从来没出过问题。 |
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e***o
发帖数: 344 | 31 不知道哪位大侠有做过这个ECOP15I的酶切。说明书要求head to head的双位点才能效
果最佳。我现在的是tail to tail的双位点。酶切很不稳定，偶尔切得动。不知道有没
有什么好的办法可以提高效率。非常感谢！ |
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x*****e
发帖数: 309 | 32 比如XhoI这个酶需要的保护碱基比较多，需要6-7个，XhoI NNNN EcoR1,两者之间间隔
很小，可以先XhoI切。如果同时切，XhoINNNN 这样的分子就可能XhoI切不了。空质粒
双切后，小片段也就几十个碱基，乙醇沉淀大概原理就是中和DNA负电荷，直觉小片段
应该不容易沉淀（物化忘光了，好像分子直径大于多少就不能形成溶液），在我做过的
试验中背景很少（不加Insert的阴性对照，几乎没有克隆长出），但是没有设计针对背
景的实验。 |
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n***w
发帖数: 2405 | 33 你的两个酶都是一个公司的吗？
这两个酶，我一般就是一起切。 |
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s********r
发帖数: 312 | 34 ECOR I 不是1234四种buffer随便切嘛。跟BAMH I同时切肯定没问题的，我指的是NEB的
酶。 |
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g*****y
发帖数: 6325 | 35 如果用2个酶来切，两个sticky ends是不同得，自己ligate得几率很低。 根本不需要
用phosphatase.
due
10
agarose |
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s******s
发帖数: 13035 | 36 这两个超级烂酶怎么切都没问题。你还是查查序列对不对，留没留足够的长度 |
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a*****a
发帖数: 415 | 37 fermentas的酶没用过
neb的用 neb double digest finder查
ecori和bamhi如果都是HFversion的可以用buffer 4做double digest
bamhi如果不是hf version最好在buffer3切，不然star activity强 |
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s******y
发帖数: 28562 | 38 根据我自己的经验，这个并不确实。
有一个事情是，如果两个restriction site 距离得不是很远的话，有一个切了就会
影响到另外一个的切割效率，所以产物中会有一定比例的质粒是只被切了一刀的。
这种质粒会很容易被连接起来，所以不需要占产物的很高比例（即使只占1%）也能产生
很高的transformation effeciency. |
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b******n
发帖数: 4225 | 39 可能你的DNA量太高了，稀释成几管切然后回收抽真空浓缩
这样效果不会差的 |
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n***w
发帖数: 2405 | 40 同意ls。可能连了2个copy。。。另外backbone切干净了吗？ |
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x**2
发帖数: 255 | 41 最近一个克隆做的很郁闷，还望各位高手相助~
谢谢！
由于实验需要，要把两个DNA片断插入到昆虫细胞表达载体(pFastbac)的同一个多克隆
位点中，该表达载体内的多克隆位点有BssHII，EcoR1, Xba1和HindIII。
我要插入的片段是：
EcoR1-片段1-Nhe1（Xba1的同尾酶），和Xba1-片段2-HindIII，
我尝试过三个片段一起连接(three way ligation)，板子上长的两个点都不对（平行做
的BssHII-片段4-Nhe1，Xba1-片段2-HindIII成功得到正确质粒）。
我后来先把片段2插入到载体中，得到质粒：载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体。
然后再尝试把EcoR1-片段1-Nhe1插入，板子上长的两个点还是都不对，得到的质粒用双
酶切鉴定好像是自连质粒（虽然我双酶切的载体-EcoR1-Xba1-片段2-HindIII-载体）。
个人认为不是双酶切载体的问题，因为：1，EcoR1, Xba1两个酶切位点相隔50bp；如果只
有一个酶切动了质粒那么应该会有很多自连载体，而我的板子上只得到两个点。
我测序鉴定过载体 |
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j****x
发帖数: 1704 | 42 同事之前收到别人给寄过来的质粒，已经是大提好了的。送测序公司简单测了一个反应
，匹配。
后来同事基于这个质粒又构建了其他几个衍生，测序据说也都啥没问题。后来再做酶切
时，顺便点了个质粒对照，结果问题来了。
单酶切，双酶切，片段大小都正确。单单这个未酶切的质粒对照，不是正常超螺旋质粒
应有的迁移速率快于线形片段的情形，反而显示条带还显著大于单酶切后的线形片段。
（质粒大小6.5kb，正常的超螺旋结构约3.5-4kb,而该未切质粒显示8kb）
同事今天找我讨论，想了半天没法解释。从来没遇到这种情况，确切地说很少做质粒对
照，单双酶切正确就完了。没想到还有这种情况，怎么解释？ |
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m******5
发帖数: 1383 | 43 现在在进行一个大载体（13k）单酶切连接大片段实验
因为遇到种种问题一直不奏效，所以想设计实验把连接步骤改造为双酶切
方法设想为：将大载体单酶切线性化后，用PCR引物把线性化的质粒p出来，期中一端引
物添加一个新酶，之后把pcr产物胶回收后用新酶进行一次酶切，就形成了两个粘性末
端，于是就成为双酶切连接。
请问这样可行么? 另外 ，ＬＡ Ｔａｑ引入突变的几率大么
另外，补充问题，这么大的质粒用ｐｆｕ做定点突变靠谱么／ |
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a***a
发帖数: 40617 | 44 你知道酶的unit怎么定义的吗？
1个unit是1hr37度切1ug的DNA
比如我现在总共要切3ug的DNA，那么理论上3 units的酶就够了，但是为了保证
切的完全，一般都要overdigest，要加加倍的酶，我一般用10x
所以切3ug，需要30units的酶，neb大部分酶都是10U/ul （当然不全是如此）
那么就要3ul的酶，双酶切就要6ul
50％是甘油，那么就是3ul的甘油，保证甘油体积百分比小于2％的话（也可以用5％）
就要在150ul的总体积内酶切
这么说，一般来说，不需要做这么细的活儿也work，但是一旦你养成这种好习惯
注意细节，很少会卡在亚克隆这一步上面，这个是最简单的
我一年一般要做80～100个 construct，几乎没有不work的 |
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b*******6
发帖数: 39 | 45 因为忙着找实验室，抱歉回复晚了。谢谢大家的帮助，特别是neverthink的耐心分析。
这件事情的或许起于实验设计，克隆路线的选择，引物的设计和载体的选择，引入了过
长引物，载体酶切位点过于靠近。再往前推一下，是因为自己过于相信自己，刚到一个
地方没有向周围人请教就把引物发出去了。虽然和一个高年级博士讨论过，但是没有和
老板讨论。
和老板及周围高年资同学缺乏有效的交流是最主要的原因。4个月大概只和老板交流了4
-5次，不和老板交流的原因最主要是觉得这么简单的事情没做出来，太丢人了，做出来
再和老板沟通。其实我到丁香园上翻了好多克隆失败分析的帖子，也尝试改进方法，如
加入一段片段在两个内切酶位点间。但是问题的关键是我没有向周围老板可以信任的人
或者老板询问改进方法，我的一些尝试没有得到他的认可（事实也说明只有在在内切酶
位点间插入片段是可行的，其他还有不少尝试我没说出来，比如说是否用碱性磷酸酶处
理、酶切时间长短、片段与质粒比例、连接酶连接时间长短、次序酶切与双酶切），他
是对的，博士生不是来改进技术的或者闭门造车的。几个月只做出几个克隆是一般人难
以接受的。
有一个可能也是存在的，如果... 阅读全帖 |
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d*****r
发帖数: 2583 | 46 ☆─────────────────────────────────────☆
Genemo (猜猜) 于 (Tue Feb 17 12:37:29 2009) 提到:
整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶
bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
这个问题不知道有么有高人见过而且解决过？
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢
☆─────────────────────────────────────☆
albertsmwk (Stay in Bio) 于 (Tue Feb 17 12:52:48 2009) 提到:
载体用SAP处理，过夜酶切，过夜SAP，基本可以做到没有自连
insert自连。。。。你为啥知道啊？！难不成跑胶测序？
不行用takara的long ligase kit，做10K肯定没问题 |
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a********1
发帖数: 5 | 47 我用MSCI酶切，但是这个酶是只有DCM- METHYLATION的细胞里提的PLASMID可以切，不
然会被OVERLAP，但是我对比了PLASMID，一个从DH5A，另一个从DCM-里提出来的，然后
双酶切之后都得到想要的片断呢，我也一个一个酶切，发现也是可以切成LINEAR的，为
什么呢，为什么从DCM+细胞里提出来的PLASMID也是可以被切呢 |
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a***a
发帖数: 40617 | 48 你问问题没问对啊
现在你是连接有问题
你是双酶切？酶切是否彻底？是否自连？这些都是问题
你要保证双酶切彻底的情况下用CIP treat以后再用合适的比例进行足够时间的
ligation
克隆问题是板上最常见的问题。我也觉得是最没有必要问的问题
与其这里问，不如问自己lab的师兄、师姐或者postdoc，效果会更好
因为要让别人给你troubleshoot，你至少得写几页的details |
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n****0
发帖数: 696 | 49 如图，lane1是marker，lane 2 3 6 7 是单酶切，lane 4 8 是双酶切，lane 5 9是没
有酶切的对照。我提了两个质粒，是一样的。
另外我的其中一个单酶切好像不完全，也有一个很大的带。难道我的质粒结合了什么别
的东西？
smear |
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L*****t
发帖数: 56 | 50 老板负责学校一个生物技术课程的教务，自己也会带几个本科生。这次新进实验室的一
位，女，华裔，长相抱歉不过自我感觉良好。第一天参观实验室的时候居然端着一杯咖
啡一边喝一边打招呼，还没来得及阻止就被实验室主任看到了，一通训斥后此人眼望天
空一言不发，反而是我和老板不停的道歉。
第一个实验是LB平板上挑单克隆，此人称自己会做那我就我让她挑3-4个培养。在旁边
看了几秒就发现不对，用来挑菌的枪头居然不换就继续挑下一个，赶快叫停，花了10分
钟解释什么是无菌操作，确定她听懂了后我有事离开一会儿，回来的时候发现实验台上
一堆垃圾，还有一瓶没上盖子的培养液，人早已不知去向。
第二天做酶切的时候再次犯晕，吸过样品的枪头不换直接去吸酶。我指出问题，答曰“
这几个质粒应该都是一样的，为什么要换”。!@#$%^&* 这支全新的SmaI恐怕以后只有
她自己能用了。
双酶切第一步要求25度水浴培育一小时，重复了好几次都切不开，仔细询问后才明白此
人认为25度=室温，就把EP管在室温放了一个小时。问题是实验室常年缺乏日照，异常
阴冷，墙上的温度计显示室温是18度，当然切不开。最后是昨天把一个装着T4 Ligase... 阅读全帖 |
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